生物催化氨基酸C—N裂解反應的研究進展

武耀運，陳城虎，宋 偉，胡貴鵬，劉 佳，吳 靜

(1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生命科學與健康工程學院，江蘇 無錫 214122)

氨基酸的脫氨反應，即氨基酸脫去氨基生成對應的酮酸和氨，是一種典型的C—N裂解反應。C—N裂解反應是生物有機體重要的生化反應。目前能催化C—N裂解反應的酶主要包括：轉氨酶(AT，EC 2.6.4.X)[1]、氨基酸脫氫酶(AADH，EC 1.4.1.X)[2]、氨裂解酶(AL，EC 4.3.1.X)和氨基酸脫氨酶(TD，EC 4.3.1.19[3]；AAD，EC 1.4.3.X[4])。AT、AADH、AL與TD、AAD相比，其不同之處主要在于：1)AT、AADH和AL的分子量大多數(shù)要比TD、AAD偏大；2)AT、AADH和AL的酶學性質大多不如TD、AAD；3)AT、AADH和AL穩(wěn)定性比TD、AAD弱。其中，AADH和AT催化的氨基酸C—N裂解反應存在：1)反應可逆且催化效率極低；2)需要添加高成本的氨基受體[5]；3)產(chǎn)品分離純化較復雜，難以達到工業(yè)化規(guī)模高產(chǎn)量、高轉化率和低成本等特點。而AL催化的氨基酸C—N裂解反應往往專一性過強，難以廣泛應用于催化氨基酸C—N的裂解反應。

氨基酸脫氨酶能催化不可逆的氨基酸C—N裂解反應，根據(jù)所需輔因子的不同，可分為：1)5'-磷酸吡哆醛(PLP)介導的氨基酸脫氨酶，代表酶為蘇氨酸脫氨酶(TD，EC 4.3.1.19)[3]；2)黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)介導的氨基酸脫氨酶，代表酶有L-氨基酸脫氨酶(LAAD，EC 4.3.1.2)[4,6-7]和L-氨基酸氧化酶(LAAO，EC 1.4.3.X)[8]。因此，在結合筆者課題組近幾年在生物催化氨基酸C—N裂解反應研究的基礎上，主要概述了氨基酸脫氨酶的研究進展，并總結了其參與多酶級聯(lián)反應合成精細化學品中的應用，展望了生物催化氨基酸C—N裂解的反應。

1 PLP介導的氨基酸脫氨酶

TD是PLP介導的氨基酸脫氨酶代表酶[3]，能催化L-Thr的α和β位消除—NH2和—OH發(fā)生C—N裂解反應，產(chǎn)生2-酮丁酸和氨，是合成2-氨基丁酸[9]、2-羥基酸[10]等藥物中間體的關鍵酶。TD的缺陷在于底物范圍較窄，對大體積非天然氨基酸底物催化效率較低[3]。因此，近年來研究人員致力于在結構解析、闡釋催化機制的基礎上，通過蛋白質工程改造，提升其催化性能。

Gallagher等[11]研究發(fā)現(xiàn)，來源于大腸桿菌(E.coli)的EcTD具有PLP的催化結構域和調控蛋白聚合的調控結構域，而來源于鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)[12]的StTD僅含催化結構域[12]，兩者催化結構域高度相似。進一步通過解析CgTD的催化機制[13]發(fā)現(xiàn)(圖1)：PLP會與CgTD Lys70位的Nε以席夫堿的形式共價連接生成中間體1，當?shù)孜镩_始反應時，L-Thr的Nα位會去親核進攻1C4'生成中間體2，之后C4'處發(fā)生轉亞胺反應，生成化合物3，然后化合物3會對L-Thr去質子化生成化合物4，再對化合物4的L-Thr醌類中間體的β-羥基進行消除，生成化合物5。在此基礎上，Lys70位的Nε對5C4'再次進行親和攻擊，生成化合物6，化合物6通過轉亞胺反應，重新生成中間體1，并釋放出產(chǎn)物亞胺，在水環(huán)境下，亞胺自發(fā)水解生成α-酮酸[3]。基于這一機制，Song等[3]通過同源建模獲得了來源于谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)的CgTD蛋白結構，經(jīng)蛋白通道計算后發(fā)現(xiàn)了“門”結構，遂提出“開門”策略，并結合丙氨酸掃描、組合位點、定點及迭代飽和突變策略，對CgTD蛋白質進行工程改造后，獲得了寬底物譜且能催化大體積的非天然氨基酸的最佳突變體M7，M7可用于生產(chǎn)天然和非天然α-酮酸，包括2-氧-丁酸(83.4 g/L，轉化率99.0%)、苯丙酮酸(72.5 g/L，轉化率95.0%)、2-氧-戊酸(21.1 g/L，轉化率91.0%)和2-氧-4-苯丁酸(29.9 g/L，轉化率84.0%)。

圖1 CgTD催化α，β-脫氨反應機制

2 FAD介導的L-氨基酸脫氨酶

FAD介導的LAAD是一種膜依賴型脫氨酶[4，6-7]，可催化C—N裂解反應生成相應的α-酮酸和氨(圖2)。LAAD主要存在于普羅登菌屬(Providenciasp.)[14]、摩爾根菌屬(Morganellasp.)[4]及變形桿菌屬(Proteussp.)[6]的細胞膜中，可與細胞膜上的電子傳遞鏈耦聯(lián)，F(xiàn)AD的電子能通過電子傳遞鏈傳遞給細胞膜上的氧化型細胞色素b，使O2分子還原為H2O，因此該酶又被稱為FAD介導的H2O生成型氨基酸脫氨酶。目前，研究主要集中于來源于Proteussp.的LAAD，根據(jù)其催化特點可分為兩類：Ⅰ型LAAD主要是來源于含黏性變形桿菌(P.myxofaciens)[6]的PmaLAAD和奇異變形桿菌(P.mirabilis)[5]的PmirLAAD，可催化L-Leu、L-Met等大體積的脂肪族氨基酸及L-Phe、L-Trp等芳香族氨基酸，此外，PmaLAAD對極性的L-Cys也有活性，而對小體積的非極性或帶電氨基酸活性較低[6]。而Ⅱ型LAAD主要來源于普通變形桿菌(P.vulgaris)[15]的PvLAAD和奇異變形桿菌(P.mirabilis)[16]的Pm1LAAD，更適合催化帶電荷的L-His、L-Arg等堿性氨基酸和含硫的L-Met，但PvLAAD對大體積非極性底物(如L-Leu)也具有催化活性。從結構上來看，Ⅰ型的PmaLAAD(PDB：5fjn)[6]和Ⅱ型的PvLAAD(PDB：5hxw)[7]均為單體蛋白且兩者結構高度相似，均包含跨膜區(qū)域、底物結合域(SBD)、FAD結合域(FBD)及插入模塊。在此基礎上，為了改善LAAD催化性能，研究人員對LAAD進行了系列蛋白質工程改造：1)增強底物結合效率。借助易錯PCR和基因融合篩選[17]，調整底物結合口袋使突變酶與底物的親和力增加，比野生酶催化活性提高了6.6倍，(D/L)-4-Phe轉化率為49.5%[18]；2)提高催化效率。通過分子對接[19](圖3)和進化保守性分析，在構建小而精突變文庫的基礎上獲得最佳突變體，對L-1-萘丙氨酸(L-1-Nal)的催化效率比野生酶提高了7倍[19]；對PmirLAAD的底物口袋、底物結合力和底物入口通道，進行理性改造，顯著提高了苯丙酮酸(72.5 g/L，轉化率96.0%)、α-酮異丁酸酯(107.1 g/L，轉化率98.0%)和α-酮-β-甲基戊酸酯(98.9 g/L，轉化率99.0%)的催化效率[20]；3)提高穩(wěn)定性。通過對PvLAAD表面的INS疏水殘基進行定點突變，提高了溶液中的穩(wěn)定性；4)提高產(chǎn)物轉化率。通過易錯PCR和定點飽和突變獲得突變體，并敲除E.coli中的L-Phe降解途徑，能將L-Phe轉化為10 g/L苯丙酮酸，轉化率為100%，進一步通過加強FAD合成，還原型輔因子(FADH2)/FAD再生，可使PPA產(chǎn)量增加到31.4 g/L[21]；5)減少產(chǎn)物抑制。通過修飾PmirLAAD產(chǎn)物結合區(qū)域周圍的柔性環(huán)獲得4突變體PmLAADM4，突變體轉化酮纈氨酸的產(chǎn)物抑制率比野生型降低6.7倍[22]；6)拓展底物譜。通過蛋白質工程改造，縮短氫化物轉移距離拓展了LAAD的底物譜，高效催化6種L-氨基酸的氧化脫氨，直接合成α-酮酸類化合物(產(chǎn)量>100 g/L，轉化率>90.0%)[5]。

圖2 FAD介導的H2O生成氨基酸脫氨酶的反應原理

圖3 L-1-Nal與PmaLAAD分子對接[19]

3 FAD介導的L-氨基酸氧化酶

另一類FAD介導的脫氨酶是L-氨基酸氧化酶(LAAO)，在催化L-氨基酸發(fā)生C—N裂解反應的同時，F(xiàn)ADH2將O2氧化成H2O2，并生成α-酮酸和氨(圖4)。LAAD的分類及其催化底物特異性[6，8，15，23]見表1。這一類酶廣泛存在動物(如毒蛇、哺乳動物的肝臟腎臟等器官)[24]、真菌[25]、藍藻[25]及細菌[25-28]中，不同來源的LAAO底物范圍不同，因此分為廣譜型和專一型兩類。

圖4 FAD介導的H2O2生成氨基酸脫氨酶反應原理

表1 LAAD分類及其催化底物特異性

專一型LAAO主要包括L-谷氨酸氧化酶(LGOX，EC 1.4.3.11)[30-31]、L-天冬氨酸氧化酶(LASPO，EC 1.4.3.16)[32]、L-精氨酸氧化酶(LAROD，EC 1.4.3.25)[33]及甘氨酸氧化酶(ThiO，EC 1.4.3.19)[34-35]等。這一類酶只能催化單一的L-氨基酸或者類似物的C—N裂解反應生成α-KG[31]、草酰乙酸[32]、2-酮精氨酸[33]、乙醛酸[35]以及氨和H2O2。目前對該類酶的研究主要包括: 1)通過核糖體結合位點(RBS)工程結合高密度發(fā)酵實現(xiàn)LGOX過表達，增加酶蛋白的產(chǎn)量，進而提升其發(fā)酵酶活力；2)通過包涵體復性的方式來提高E.coli表達LASPO的活性蛋白產(chǎn)量[32]；3)發(fā)現(xiàn)并表征了Pseudomonassp.TPU 7192 來源的LAROD，鑒定其為FAD依賴型酶，并表明在不去除L-Arg氧化形成的H2O2的情況下，2-酮精氨酸會經(jīng)過非酶催化轉化為4-胍基丁酸[33]；4)通過構建B.subtilis168菌株實現(xiàn)ThiO可溶性表達，并全細胞轉化Gly生產(chǎn)乙醛酸[35]。此外，這些酶在催化反應過程中產(chǎn)生H2O2可被H2O2電極捕獲，可用于臨床檢測、發(fā)酵生產(chǎn)、食品安全檢測、L-氨基酸的定量分析、生物傳感器、D/L-氨基酸的拆分等方面[30-31,36-37]。這些研究為解決L-谷氨酸氧化酶及L-天冬氨酸氧化酶表達量低這一難題提供了新的思路和方法，為對L-精氨酸氧化酶的結構及底物特異性機制解析、蛋白質工程改造與其催化氨基酸C—N裂解反應的應用奠定了基礎。

除了上述酶外，目前已報道的底物專一性的H2O2生成型LAAO還有苯丙氨酸氧化酶[38]、色氨酸氧化酶[39]及賴氨酸氧化酶[40]，這些酶可催化其專一性的底物生成對應的α-酮酸、氨和H2O2。與上述酶類似，該類酶的一個共性的問題是不易實現(xiàn)很好地異源表達，從而限制了該類酶在工業(yè)方面的應用。未來可以通過蛋白質工程策略實現(xiàn)這類酶的可溶性表達，加上結構及機制解析，使這類酶更好地發(fā)揮其功能。

4 氨基酸脫氨酶在多酶級聯(lián)反應中的應用

多酶級聯(lián)反應通過將多個酶進行組裝，利用“一鍋煮”的方法從廉價易得的底物出發(fā)，合成高價值目標產(chǎn)物。其中PLP介導的氨基酸脫氨酶主要集中在多酶級聯(lián)生產(chǎn)L-2-氨基丁酸[9]、α-羥基酸(2-羥基丁酸)[3]及非天然α-酮酸[41]等產(chǎn)品；而FAD介導的氨基酸脫氨酶則主要集中在多酶級聯(lián)生產(chǎn)天然α-酮酸[5]、D型氨基酸及其衍生物(D-Phe[42]、D-Tyr[43]、D-Trp及其對應的衍生物[44]、D-對羥基苯甘氨酸[45]和D-丹參素[46]等)、R/S-羥基酸(R/S-羥基蛋氨酸[47]、R/S-4-羥基苯基乳酸[48])、芳香醇[49-50]、7-氯吲哚-2-氨基丙酸[51]、α-氨基腈[52]、非天然α-氨基酸[52]和α-酮戊二酸[31]等產(chǎn)品(表2)。

表2 多酶級聯(lián)反應生產(chǎn)精細化學品匯總

4.1 PLP介導的氨基酸脫氨酶在多酶級聯(lián)反應中的應用

L-Thr脫掉側鏈羥基后生成L-2-氨基丁酸(L-ABA),是合成抗癲癇藥物的重要前體。但自然界中沒有直接催化L-Thr形成L-ABA的酶，因此，研究者們設計了由TD、L-亮氨酸脫氫酶(LeuDH)和甲酸脫氫酶(FDH)組成的三酶級聯(lián)路徑(圖5(a))，并通過構建共表達菌株、高密度發(fā)酵、全細胞轉化等策略，生產(chǎn)L-ABA產(chǎn)量達到68.5 g/L，轉化率為99.0%[9]。2-羥基丁酸(2-HB)是生產(chǎn)左乙拉坦和布拉西坦等抗癲癇藥物的重要前體[41]。Yao等[10]通過構建SeD-LDH和OcL-LDH和EcTD、CbFDH三酶共表達菌株，實現(xiàn)了L-Thr轉為78.0 g/L(R/S)-2-HB(圖5(b))，其轉化率≥90.0%，對映體過量(e.e.)值>99.0%[10]。非天然α-酮酸是精細化學合成中的重要組成部分，但目前缺乏用生物催化合成非天然α-酮酸的方法[41]。筆者所在的團隊設計了一個CgTD和蘇氨酸醛縮酶(TA)結合的雙酶級聯(lián)路徑，將Gly和醛轉化為9種多功能α-酮酸(圖5(c))，從而建立了高效合成α-酮酸的平臺[3]。

圖5 PLP介導的氨基酸脫氨酶參與多酶級聯(lián)反應

4.2 FAD介導的氨基酸脫氨酶在多酶級聯(lián)反應中的應用

氨基酸脫氨酶廣泛應用于催化L-型氨基酸合成D-氨基酸，典型案例包括: 1)由LAAD、內消旋-二氨基庚二酸脫氫酶(DAPDH)和葡萄糖脫氫酶(GDH)或甲酸脫氫酶(FDH)組成的三酶級聯(lián)反應，催化α-氨基的構型翻轉，用于催化合成D-Phe[42](產(chǎn)量57.8 g/L，轉化率96.3%，e.e.值>99.0%,圖6(a))和D-Tyr[43](產(chǎn)量18.1 g/L，轉化率為45.3%，e.e.值>99.0%，圖6(a))；2)由苯丙氨酸裂合酶(PAL)[51]或色氨酸合成酶(TrpS)[44]、LAAD和D-氨基轉移酶(DAAT)組成的級聯(lián)反應用于合成不同的苯丙氨酸[53](圖6(b))及色氨酸衍生物[44](圖6(c))；3)由LAAD、4-羥基扁桃酸合酶(HmaS)、(S)-扁桃酸脫氫酶(MDH)以及內消旋-二氨基庚二酸脫氫酶(DAPDH)四酶組成的級聯(lián)反應可合成42.7 g/L D-對羥基苯甘氨酸(D-HPG)[45](轉化率為92.5%,圖6(d))；4)由酪氨酸酚裂解酶(TPL)、LAAD、D-乳酸脫氫酶(DLDH)和葡萄糖脫氫酶(GDH)四酶組成的多酶級聯(lián)反應以鄰苯二酚和丙酮酸為原料，合成1.05 g/L D-丹參素(D-DSS)[46](圖6(e))。

圖6 FAD介導的氨基酸脫氨酶參與多酶級聯(lián)反應生成D-Phe、D-Tyr、D-色氨酸衍生物、D-苯丙氨酸衍生物及D-丹參素

FAD介導的氨基酸脫氨酶可用于合成羥基蛋氨酸[47]及羥基苯基乳酸[48]，如由LAAD、D/L-LDH和FDH組成的級聯(lián)反應(圖7(a))催化L-蛋氨酸合成羥基蛋氨酸(2-羥基-4-甲硫基丁酸)[47]，該級聯(lián)反應的第一階段酮蛋氨酸轉化率為99.6%，第二階段(R/S)-羥基蛋氨酸的轉化率及e.e.值均大于95.8%[47]。而以L-Tyr 為底物，通過LAAD、D/L-HicDH和FDH組成的級聯(lián)催化路線(圖7(b))，可生成(R/S)-4-羥基苯基乳酸(4-HPLA)，轉化率及e.e.值均大于98.0%[48]。同樣以L-Tyr 為底物，由LAAD、丙酮酸脫羧酶(PDC)、乙醇脫氫酶(ADH)和GDH組成的級聯(lián)反應則催化生成酪醇[49](圖8(a))，32 h總產(chǎn)量能達到35.7 g/L，轉化率為93.6%[49]。另一研究案例是以L-Phe或L-Tyr為底物，由LAAD、羥杏仁酸合成酶(HmaS)、(S)-扁桃酸脫氫酶(MDH)、苯甲酰甲酸脫羧酶(BFD)和苯乙醛還原酶(PAR)組成的五酶級聯(lián)路線，可催化生成苯甲醇[50]或4-羥基芐醇[50](圖8(b))，最終轉化率分別為99.0%和93.6%。

圖7 FAD介導的氨基酸脫氨酶參與多酶級聯(lián)反應用于生產(chǎn)(R/S)-羥基蛋氨酸及(R/S)-4-羥基苯基乳酸

圖8 FAD介導的氨基酸脫氨酶參與多酶級聯(lián)反應用于生產(chǎn)酪醇、苯甲醇及4-羥基苯甲醇

4.3 FAD介導的氨基酸氧化酶在多酶級聯(lián)反應中的應用

FAD介導的氨基酸氧化酶可用于合成蝴蝶霉素前體7-氯吲哚-2-氨基丙酸、α-氨基腈、非天然α-氨基酸和α-酮戊二酸，主要案例包括: 1)以L-Trp為底物由色氨酸-7-鹵化酶(Trp 7-halogenase)和LAAO級聯(lián)反應生成7-氯吲哚-2-氨基丙酸，7-氯吲哚-2-氨基丙酸經(jīng)進一步的生物合成步驟可生成蝴蝶霉素,7-氯吲哚-2-氨基丙酸轉化率>90.0%[52](圖9(a));2)以苯丙氨酸為底物使用氨基酸氧化酶與化學HCN水解反應級聯(lián)合成α-氨基腈，然后α-氨基腈在氰水解酶AY487533的催化下合成非天然α-氨基酸-2EtPG產(chǎn)量為28.6 g/L,轉化率達73.0%[53](圖9(b));3)以L-Glu為底物將LGOX和Kcat耦聯(lián)生產(chǎn)α-酮戊二酸，產(chǎn)量達103.1 g/L，轉化率為 94.6%[31](圖9(c))。

圖9 FAD介導的氨基酸氧化酶參與多酶級聯(lián)反應生成蝴蝶霉素、α-氨基腈(2EtPG)和α-酮戊二酸

5 結論與展望

針對氨基酸脫氨酶催化氨基酸C—N裂解脫氨反應相關研究，國內外的研究進展主要體現(xiàn)在2個方面：一是PLP介導的蘇氨酸脫氨酶的結構解析、機制解析、蛋白質工程改造及其在多酶級聯(lián)中的應用；二是FAD介導的氨基酸脫氨酶和氨基酸氧化酶的表達、蛋白質工程改造及其在多酶級聯(lián)反應中的應用。然而，由于氨基酸脫氨酶/氧化酶自身在原核生物中表達量低、三維結構及其催化機制不夠清晰、催化效率低、底物范圍窄，轉化過程條件繁多且復雜等瓶頸問題，導致多酶級聯(lián)反應路線合成的目標產(chǎn)物產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強度較低。因此，為了提高氨基酸脫氨酶/氧化酶的催化性能，今后的研究需要：1)利用X線衍射及冷凍電鏡等技術解析氨基酸脫氨酶/氧化酶三維晶體結構并借助動力學模擬、量子力學及密度泛函理論，解析酶催化機制；2)通過蛋白質工程改造策略對氨基酸脫氨酶/氧化酶進行理性改造，提高其催化性能；3)深入研究酶固定化技術，降低生產(chǎn)成本，為實現(xiàn)氨基酸C—N裂解的工業(yè)化應用奠定堅實基礎。并將前述研究中涉及的重要新技術的革新意義延伸到生物催化領域中，主要包括：使用冷凍電鏡解析蛋白結構新技術的革新指向結構生物學方向；利用計算化學解析催化機制指向理論生物化學計算方向；蛋白質理性改造新技術指向構建小而精的突變文庫進而推進蛋白進化方向；酶固定化新技術為今后生物催化領域提出經(jīng)濟化應用的方向。