11種殺菌劑對柑桔褐腐疫霉Phytophthora citrophthora的室內(nèi)毒力

葉泉清，陳晶晶

(1 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林，541006；2 廣西達(dá)慶生物科技有限公司，廣西貴港，537300)

柑桔在栽培中常遭受疫霉菌侵害，引發(fā)腳腐病、褐腐病等病害。在不同地區(qū)，寄生柑桔的疫霉種類有所不同，造成的損害不同。有研究表明，柑桔褐腐疫霉Phytophthoracitrophthora分布廣，寄主范圍較寬，檢出率高，是海南、廣東湛江柑桔腳腐病的主要致病菌[1]，在四川該菌可引致柑桔腳腐病和根腐病[2-3]，在廣東該菌是為害柑桔的主要疫霉種群[4]，也可造成貯藏柑桔果實腐爛[5]，可侵染幼苗導(dǎo)致柑桔苗疫病[6]，可侵染臍橙[7]、夏橙[8]、不知火雜柑[9]、溫州蜜柑[10]、沙田柚等多種果實[11-13]造成果腐，近年該菌引發(fā)廣西桂林部分檸檬園發(fā)生葉疫、果腐[14]?？梢哉J(rèn)為，該菌為害嚴(yán)重，在柑桔疫霉病害中的重要性較大。該菌為害潛育期短，病情發(fā)展快，例如，江西贛州臍橙果實發(fā)病后病斑在3～5 d達(dá)到果面1/3左右即落果[7]；以菌絲和厚垣孢子在病株或土壤里的殘體上越冬，翌年菌絲生長并產(chǎn)生孢子囊釋放游動孢子，隨水流或雨水滴濺侵染葉片、果實，導(dǎo)致發(fā)病，潮濕、多雨天氣有利于菌絲擴展和孢子囊形成，再侵染次數(shù)多，以致傳播很快。生產(chǎn)上常用殺菌劑有甲霜靈、三乙膦酸鋁、霜脲氰、烯酰嗎啉、百菌清、代森錳鋅及各種銅制劑等，這些藥劑已經(jīng)使用多年甚至30年以上。目前，殺菌劑對柑桔褐腐疫霉的室內(nèi)毒力測定研究相對較少。甲霜靈屬于苯基酰胺類的內(nèi)吸殺菌劑，在防治卵菌病害上獲得廣泛的應(yīng)用，但由于作用位點單一，病原菌容易產(chǎn)生抗藥性。已報道有多種疫霉菌對甲霜靈產(chǎn)生抗性，導(dǎo)致防效下降[15]。因此，有必要監(jiān)測柑桔疫霉病菌對甲霜靈等藥劑的敏感性，并且篩選新的殺菌劑，以增加可供選用的藥劑品種，減緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生。本研究選擇具有不同作用機制的殺菌劑，對采集于桂林的檸檬褐腐病菌株進(jìn)行了室內(nèi)毒力測定，以期篩選出高效藥劑，為病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株從廣西桂林檸檬園采集患褐腐病的病果，經(jīng)組織分離和純化、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，確定獲得的菌種為柑桔褐腐疫霉[14]。供試菌株由廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室保存，將菌株轉(zhuǎn)移至10%V8培養(yǎng)基斜面上，置于15 ℃恒溫箱內(nèi)備用，使用前先進(jìn)行活化。

10%V8汁瓊脂培養(yǎng)基(V8A)：將V8汁離心后取澄清液100 mL，CaCO30.2 g，瓊脂20 g，加去離子水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 供試藥劑供試的11種殺菌劑分別為甲霜·錳鋅、三乙膦酸鋁、霜脲氰、烯酰嗎啉、氟菌·霜霉威、雙炔酰菌胺、氟噻唑吡乙酮、百菌清、代森錳鋅、氫氧化銅、丁子香酚，各藥劑的生產(chǎn)廠家、劑型、有效成分含量和毒力測試配制濃度見表1。

表1 供試藥劑、生產(chǎn)廠家及毒力測試的濃度設(shè)置

1.3 試驗方法采用菌絲生長速率法測定毒力。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，在無菌條件下，用無菌水配制供試藥劑的母液并稀釋成比設(shè)置濃度高10倍的系列母液，用移液槍量取藥劑各濃度母液1 mL加入9 cm培養(yǎng)皿中，再分別加入滅菌并冷卻至55 ℃左右的V8A 9 mL，混合搖勻，即制成系列質(zhì)量濃度的含藥培養(yǎng)基。供試柑桔褐腐疫霉菌活化后，接種在V8A上，25 ℃恒溫箱培養(yǎng)4 d，用直徑8 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，菌絲面朝下接種到不同濃度的含藥培養(yǎng)基上，每皿在中心放一塊菌餅，每處理重復(fù)3次，以不加入藥劑的V8A接種菌餅作為對照。接種后，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，4 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析將菌絲生長抑制率換算成幾率值，藥劑有效成分濃度轉(zhuǎn)換成濃度對數(shù)，用SPSS軟件作統(tǒng)計分析，求出毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)和有效抑制中濃度(EC50)，評估殺菌劑的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

試驗結(jié)果看出，各殺菌劑毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)均在0.97以上，表明藥劑濃度與抑制作用呈現(xiàn)較高的相關(guān)性。供試11種殺菌劑對柑桔褐腐疫霉菌菌絲生長均有不同程度的抑制作用。其中，氟噻唑吡乙酮、雙炔酰菌胺的抑制作用最強，EC50值很低，分別為0.000 6和0.011 6 mg/L；烯酰嗎啉、氟菌·霜霉威和霜脲氰的抑菌作用比較好，EC50值均<1 mg/L，分別為0.464 8、0.608 8、0.647 1 mg/L；甲霜·錳鋅的抑菌作用一般，EC50值為4.034 0 mg/L；代森錳鋅、百菌清、三乙膦酸鋁、氫氧化銅和丁子香酚的抑菌作用比較弱，EC50值分別為13.230 0、25.400 0、41.740 0、69.150 0和71.510 0 mg/L(見表2)。

3 討論

疫霉菌在分類上屬于卵菌，具有許多不同于真菌的特征，造成植物疫病較難防治。柑桔褐腐疫霉?jié)撚诙?，再侵染次?shù)多，常引發(fā)柑桔苗疫病或褐腐病的暴發(fā)流行，化學(xué)防治仍然是控制病害的有效措施之一。目前，市場上防治疫病的殺菌劑主要針對番茄疫病、馬鈴薯晚疫病、煙草黑脛病和辣椒疫病等，因此，有必要篩選針對柑桔褐腐疫霉的有效防治藥劑。本研究選用具有不同作用機制的11種殺菌劑，測定其對柑桔褐腐疫霉的室內(nèi)毒力。結(jié)果表明，不同藥劑對柑桔褐腐疫霉菌絲生長的抑制作用有明顯差異，抑制作用最強的是氟噻唑吡乙酮和雙炔酰菌胺，其次是烯酰嗎啉、氟菌·霜霉威和霜脲氰，抑制作用一般的是甲霜·錳鋅，抑制作用差的是代森錳鋅、百菌清、三乙膦酸鋁、氫氧化銅和丁子香酚。

用來防治柑桔褐腐疫霉病害的內(nèi)吸性殺菌劑，早期藥劑有甲霜靈、三乙膦酸鋁和霜脲氰，后來增加了烯酰嗎啉和嘧菌酯等。本測定結(jié)果反映出柑桔褐腐疫霉對甲霜靈、三乙膦酸鋁的敏感性降低，而對霜脲氰、烯酰嗎啉仍較為敏感。據(jù)報道，甲霜靈由于其作用位點單一，容易導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性，涉及的疫霉種包括柑桔褐腐疫霉；而霜脲氰的使用遠(yuǎn)不如甲霜靈面積廣泛和時間長久，認(rèn)為疫霉菌對霜脲氰產(chǎn)生抗性的風(fēng)險較小[16]。烯酰嗎啉屬于羧酸酰胺類殺菌劑，與甲霜靈等苯酰胺類殺菌劑無交互抗性，成為繼甲霜靈之后用于植物疫病防治的主要藥劑，在治理柑桔褐腐疫霉對苯酰胺類殺菌劑的抗藥性中起到了重要作用。羧酸酰胺類殺菌劑研發(fā)的突破性進(jìn)展是開發(fā)出扁桃酰胺類殺菌劑雙炔酰菌胺，于2007年投入市場。雙炔酰菌胺與植物表面的蠟質(zhì)層具有很高的親合力，噴灑后大部分被吸附很難被雨水沖洗掉，滲透組織的活性成分足以抑制菌絲生長，具有穩(wěn)定高效、持效期長的特征[17]。氟噻唑吡乙酮于2016年在我國正式登記，該藥劑作用位點新穎，通過對氧化固醇結(jié)合蛋白的抑制達(dá)到殺菌效果，施藥后可被植物蠟質(zhì)層快速吸收，有效防止雨水沖刷，具有治療和保護作用[18]。本研究中，氟噻唑吡乙酮和雙炔酰菌胺的EC50值很小，對柑桔褐腐疫霉菌絲生長的抑制活性高，可作為防治首選用藥。柑桔褐腐病受水分影響較大，降雨多，果園濕度大，病情發(fā)展快，而雨日多不利于用藥防治，因而防治難度大；但上述兩種藥劑施治后具有耐雨水沖刷的特點，有助于在陰雨天氣控制病情，提高防治效果。張培花等[13]研究了瑞麗市柚果疫病病原柑桔褐腐疫霉P.citrophthora對4種藥劑各3個稀釋濃度的敏感性，結(jié)果表明烯酰嗎啉和甲霜靈·霜霉威的抑菌效果較好，而多寧可濕性粉劑幾乎沒有抑菌作用，后者屬有機銅殺菌劑，結(jié)果與本研究相似。黃景龍等[19]開展了21種殺菌劑對柑桔腳腐病菌寄生疫霉P.parasitica的室內(nèi)篩選，結(jié)果表明50%烯酰嗎啉的毒力最強，EC50值為0.259 8 μg/mL，好于醚菌酯、代森鋅、硫酸銅等。本研究中，烯酰嗎啉對柑桔褐腐疫霉P.citrophthora的EC50值為 0.464 8mg/L。

尹敬芳等[20]測定了9種殺菌劑對辣椒疫霉P.capsici各生長階段的抑制作用，結(jié)果表明烯酰嗎啉對病菌的4個發(fā)育階段(菌絲生長、孢子囊形成、游動孢子休止孢萌發(fā)、孢子囊直接萌發(fā))均有顯著抑制作用，而三乙膦酸鋁的抑制作用較弱，百菌清、代森錳鋅可抑制孢子囊形成、游動孢子休止孢萌發(fā)和孢子囊直接萌發(fā)，但對菌絲生長沒有直接抑制作用。在本研究中，百菌清、代森錳鋅和氫氧化銅對柑桔褐腐疫霉P.citrophthora菌絲生長的抑制效果也較差。

與辣椒疫霉P.capsici類似，柑桔褐腐疫霉不同發(fā)育階段對不同藥劑的敏感性也可能不同。因此，在柑桔苗疫、褐腐病發(fā)生的不同階段應(yīng)當(dāng)選用不同的殺菌劑。在發(fā)病前或發(fā)病初期宜使用保護性殺菌劑，當(dāng)侵染蔓延時使用活性高的內(nèi)吸殺菌劑控制菌絲生長和擴展。同時，用藥還要符合殺菌劑抗性治理策略，將不同作用機理或類型的藥劑混用或輪換使用。例如，氟噻唑吡乙酮因作用位點單一具有中高水平抗性風(fēng)險[18]，可與多作用位點的保護性殺菌劑代森錳鋅混用，以延緩抗藥性發(fā)生。一般果園在幼果發(fā)病或果實成熟期發(fā)現(xiàn)零星病果，遇雨天較多，應(yīng)及時全園噴藥，建議采用10%氟噻唑吡乙酮可分散油懸浮劑2 000～3 000倍液+80%代森錳鋅500～800倍液，用藥3次，間隔期7～10 d，視天氣情況和發(fā)病程度而調(diào)整；對于往年病情較重的果園，重點對樹冠中、下部果實及樹冠下土壤表面進(jìn)行噴藥。除治療用藥外，也可以在較長時間的陰雨天氣或臺風(fēng)雨前后噴藥1～2次進(jìn)行保護。雙炔酰菌胺可作為氟噻唑吡乙酮的輪換藥劑使用。柑桔苗圃發(fā)生苗疫病，在出現(xiàn)發(fā)病中心時須及時施藥，所用藥與上述褐腐病相似，采用淋澆苗地結(jié)合植株噴霧的方式施藥。柑桔疫病的發(fā)生流行與環(huán)境條件、氣候因素、栽培管理等密切相關(guān)，應(yīng)實行綜合防治。一些合理的管護措施，例如隨時清理病果、防止低洼積水降低果園濕度、剪枝撐果改善果園通風(fēng)透光等，可減輕發(fā)病或提升藥劑施治效果。

本試驗室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果拓寬了防治柑桔苗疫、褐腐病的藥劑選擇范圍，為田間藥劑防治提供了理論依據(jù)，對防治柑桔腳腐病也有參考意義；藥劑的有效性有待田間試驗進(jìn)行驗證。