氣相色譜法測定羥乙基嗎啉中嗎啉含量的研究

鄧 麗，楊寶強，謝 天

(國藥集團川抗制藥有限公司，四川 成都 611730)

嗎啉，又稱嗎啡啉、1,4-氧氮雜環(huán)環(huán)己烷，具吸濕性和特殊氨味的無色油狀液體，易溶于水、芳烴、醇、酮、醚和有機溶劑中。嗎啉含有仲胺基團，具有仲胺基團的所有典型反應特征，如與無機酸生成鹽、與有機酸生成鹽或酰胺、烷基化反應、與環(huán)氧乙烷或酮進行willgerodt反應等等，羥乙基嗎啉正是以嗎啉和環(huán)氧乙烷反應合成而得[1-3]。

羥乙基嗎啉與麥考酚酸反應可合成嗎替麥考酚酯(一種免疫抑制藥)，是生產(chǎn)嗎替麥考酚酯的關(guān)鍵中間體。我司在研究嗎替麥考酚酯課題中發(fā)現(xiàn)，羥乙基嗎啉殘留的嗎啉(合成過程殘留或儲存過久緩慢分解產(chǎn)生)，極易與麥考酚酸反應生成酯類或酰胺類副產(chǎn)物，增加嗎替麥考酚酯分離純化的工藝難度，影響嗎替麥考酚酯的質(zhì)量，且存在潛在的安全性風險[4-5]。故嗎替麥考酚酯合成工藝需嚴格控制羥乙基嗎啉中嗎啉的含量，盡可能減少副產(chǎn)物產(chǎn)生。但尚未見羥乙基嗎啉中嗎啉檢測方法的文獻報道。

目前，嗎啉的檢測方法主要有氣相色譜(質(zhì)譜)法[6-11]、液相色譜(質(zhì)譜)法[12-13]、離子色譜法[14-15]。嗎啉的分子結(jié)構(gòu)決定其為幾乎無紫外吸收，故液相色譜法(紫外檢測器)的靈敏度和準確度效果不佳，需與質(zhì)譜聯(lián)用；離子色譜法尚還在探索中；氣相色譜法較成熟，靈敏度高，對含嗎啉的微量雜質(zhì)檢測比較適宜。本文首次采用氣相色譜法測定羥乙基嗎啉中嗎啉的含量，旨在為含嗎啉雜質(zhì)的產(chǎn)品或中間體(如羥乙基嗎啉)的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

7890B型氣相色譜儀，(配置FID檢測器)，美國美國 Agilent公司；BP211D型Sartorius電子分析天平(感量0.01mg)，上海精科儀器廠。

1.2 試 藥

羥乙基嗎啉(分析級)，國藥集團化學試劑有限公司；嗎啉(分析級)，成都市科龍化工試劑廠；甲醇(色譜級，F(xiàn)isher)，羥乙基嗎啉(自制，批號：Z0107、Z0501、Z0502、Z0601)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定相(30 m×0.53 mm×3.0 μm)；載氣：氮氣；流速：3.0 mL/min；柱溫條件：起始溫度為150 ℃，維持3 min，以20 ℃/min速率升溫至240 ℃，維持10 min；進樣口溫度：230 ℃；檢測器溫度：260 ℃；分流方式：分流進樣，分流比為15:1；進樣量：1 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取羥乙基嗎啉(自制)適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含100 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.3 對照品溶液的配制

分別精密稱取嗎啉、羥乙基嗎啉各適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中分別約含嗎啉1 mg、羥乙基嗎啉100 mg的混合溶液，作為混合對照品溶液。取嗎啉適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL約含嗎啉1 mg的溶液，作為嗎啉對照品溶液；取羥乙基嗎啉適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL約含羥乙基嗎啉100 mg的溶液，作為羥乙基嗎啉對照品溶液。以甲醇溶液為陰性對照溶液。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性與系統(tǒng)適用性試驗

精密吸取陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液，依法進樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，甲醇對與嗎啉、羥乙基嗎啉測定無干擾，專屬性良好；嗎啉與羥乙基嗎啉峰分離度>1.5，理論塔板數(shù)>10000，滿足檢測要求，系統(tǒng)適用性良好。陰性對照、對照品和供試品色譜圖見圖1。

圖1 嗎啉和羥乙基嗎啉GC圖譜

2.4.2 檢測限和定量限測定

吸取嗎啉對照品溶液加甲醇逐級稀釋后，依法進樣，記錄色譜圖。按信噪比(S/N)約為2時作為檢測限、S/N約為10時作為定量限來處理，嗎啉的檢測限為2.01 ng，定量限為 10.06 ng。

2.4.3 線性關(guān)系考察

取嗎啉對照品溶液，加甲醇稀釋2、10、20、50和100倍濃度的對照品溶液，依次進樣，記錄峰面積，以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。結(jié)果表明，在嗎啉在10.06～500.3 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性回歸方程為：y=453.39x-4.475，R2=0.9995。

2.4.4 精密度試驗

吸取嗎啉對照品溶液，依法連續(xù)進樣6次，記錄嗎啉的峰面積。結(jié)果，嗎啉峰面積的RSD=1.67%。

2.4.5 重復性試驗

取羥乙基嗎啉樣品(批號：Z0107)，按“2.2供試品溶液的制備”項平行制備供試品溶液6份。依法進樣，記錄峰面積，按外標法計算樣品中嗎啉的含量，結(jié)果見表1。

表1 重復性試驗結(jié)果

2.4.6 加樣回收率試驗

精密稱取嗎啉42.15 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；再從中吸取1mL置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為嗎啉對照品儲備液。取已知含量樣品(批號：Z0107)9份，每份約0.5 g，分別置10 mL量瓶中，將9份樣品分成3個組，每組3個平行，吸取嗎啉對照品儲備液0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL各3份置9個樣品中，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為加樣回收率供試品溶液。依法進樣，記錄色譜圖，按外標法計算供試品溶液中嗎啉的測得量，并計算回收率。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

2.4.7 耐用性試驗

取羥乙基嗎啉樣品(批號：Z0107)的供試品溶液，將“2.1色譜條件”作微調(diào)，調(diào)整色譜柱初始溫度、進樣口與檢測器溫度、分流比，記錄峰面積，計算樣品中嗎啉含量。

表3 耐用性試驗結(jié)果

2.4.8 樣品測定

取三批樣品(Z0501、Z0502、Z0601)各約1 g，按“2.2供試品溶液的制備”項制備供試品溶液，依法進樣，記錄峰面積，按外標法計算樣品中嗎啉的含量，見表4。

表4 三批羥乙基嗎啉樣品中嗎啉含量測定結(jié)果

3 結(jié) 論

羥乙基嗎啉是由適量的環(huán)氧乙烷和過量的嗎啉合成制得，由于嗎啉和羥乙基嗎啉結(jié)構(gòu)相似，嗎啉極有可能殘留在羥乙基嗎啉中，兩者化學性質(zhì)也存在相似之處，檢測過程中分離度難以符合要求。

以羥乙基嗎啉作為藥物組成部分或者作為中間體反應合成嗎替麥考酚酯，都有必要對雜質(zhì)嗎啉進行研究。本研究首次采用氣相色譜法測定羥乙基嗎啉中嗎啉的含量，方法學考察結(jié)果表明，在選定的色譜條件下，嗎啉與羥乙基嗎啉能夠完全分離，空白溶劑無干擾、系統(tǒng)適用性良好、靈敏度高、在10.06～500.3 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好、重復性良好和準確度高，可有效控制極微量嗎啉的含量。

本研究所建立的氣相色譜法測定羥乙基嗎啉中嗎啉含量的方法切實可行，操作簡單，將會為含有嗎啉的雜質(zhì)的產(chǎn)品或中間體質(zhì)量研究提供依據(jù)。