氨基酸/氧化石墨烯/羥基磷灰石復(fù)合材料在酸蝕人牙釉質(zhì)體外再礦化中的應(yīng)用

蔡 英，釧定澤，陳慶華，劉繼濤

(1.云南白藥集團(tuán)健康產(chǎn)品有限公司，昆明 650217；2.昆明理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，昆明 650093)

0 引 言

成熟的人牙釉質(zhì)(human enamel, HE)是一種高度礦化的組織，由95%～97%的無(wú)機(jī)礦物質(zhì)組成[1]。無(wú)機(jī)礦物質(zhì)主要由羥基磷灰石(HA)晶體組成[2]，這種HA晶體呈六角晶柱狀，平行排列且垂直于牙釉質(zhì)表面，形成納米級(jí)HA棱柱結(jié)構(gòu)[3]。正常情況下，HE是一種相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，脫礦和再礦化處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。然而，當(dāng)這種平衡被破壞后，會(huì)使牙釉質(zhì)脫礦[4]并可能生成早期齲齒。

臨床上針對(duì)早期釉質(zhì)齲，主要采用氟化物進(jìn)行再礦化治療。但氟化物過(guò)量會(huì)導(dǎo)致氟斑牙、氟骨癥、急性氟中毒等毒副作用[5-6]。仿生牙釉質(zhì)再礦化是一種新的、現(xiàn)代的早期齲齒治療方法[7]。釉原蛋白、PAMAM樹枝狀大分子、殼聚糖[8-9]、Tuftelin衍生肽[10]、自組裝肽P11-4[11]等新型材料，都能誘導(dǎo)牙釉質(zhì)仿生再礦化，在牙釉質(zhì)表面生成HA晶體。但這些材料存在很多復(fù)雜多變的問(wèn)題，不利于后續(xù)臨床應(yīng)用工作的開展。HA具有與牙齒硬組織相似的礦物質(zhì)含量，具有較高的生物活性和生物相容性[12]。單獨(dú)應(yīng)用HA材料進(jìn)行牙釉質(zhì)再礦化，主要利用其納米尺寸效應(yīng)填充脫礦部位，因此對(duì)牙釉質(zhì)齲損的再礦化作用有限。

在成釉細(xì)胞介導(dǎo)的牙釉質(zhì)無(wú)機(jī)-有機(jī)生物礦化過(guò)程中，多種蛋白質(zhì)成分起到了關(guān)鍵作用。同時(shí)，成熟牙釉質(zhì)中的少量蛋白質(zhì)殘留物，賦予其驚人的結(jié)構(gòu)力學(xué)性能[13]。這些蛋白質(zhì)殘留物的氨基酸(AA)組成主要以甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)等含量最高[14]，Linden等[15]發(fā)現(xiàn)，牛牙釉質(zhì)表層下蛋白質(zhì)在脫礦過(guò)程中丟失的氨基酸主要為Gly、Glu、Asp等，丟失的這類AA可能在礦化過(guò)程中參與了HA晶體的定向生長(zhǎng)過(guò)程[16]。Li等[17-18]研究證明，Glu和Asp能夠吸附在酸蝕釉質(zhì)晶體表面，定向排列束狀類釉質(zhì)晶體層。劉繼濤等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Glu、絲氨酸(Ser)和Asp復(fù)合改性HA材料對(duì)酸蝕牛牙釉質(zhì)體外再礦化的修復(fù)效果較好。

氧化石墨烯(GO)具有比表面積大、分散性好、可生物降解、層間嵌有豐富含氧基團(tuán)(如羥基、羧基和環(huán)氧基團(tuán))的特性，這些含氧官能團(tuán)使GO很好地分散在水溶液中，可與金屬離子或納米粒子結(jié)合[20-22]。劉繼濤等[23]研究發(fā)現(xiàn)，GO改性HA復(fù)合材料具有良好的生物相容性，應(yīng)用于酸蝕牛牙釉質(zhì)體外再礦化，可使深層脫礦的釉質(zhì)得到良好修復(fù)，并促進(jìn)了脫礦釉柱間隙中有序排列晶體的生成。

本文在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，采用化學(xué)均相沉淀法，制備了Gly/GO/HA、Asp/GO/HA復(fù)合材料和不含改性成分的HA。對(duì)復(fù)合材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)試，考察其對(duì)酸蝕人牙釉質(zhì)體外再礦化的影響，并討論不同復(fù)合材料的再礦化機(jī)制。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

氨水，分析純，廣東光華科技股份有限公司；NaN3，分析純，福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；去離子水，自制；其他試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 復(fù)合材料的制備

本文設(shè)計(jì)了3組實(shí)驗(yàn)材料，1組為不含AA和GO的HA對(duì)照組，2組為含30 mmol/L的Gly和0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))GO的Gly/GO/HA，3組為含30 mmol/L的Asp和0.05%GO的Asp/GO/HA。將Ca(NO3)2·4H2O(14.169 g，60 mmol)和對(duì)應(yīng)濃度的AA/GO溶解于1 600 mL去離子水中，超聲分散至無(wú)可見GO顆粒，得到淺黃色透明溶液。將混合物加熱，并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持(37±1)℃。將(NH4)2HPO4(4.752 g，35.98 mmol)溶于800 mL去離子水中，在約120 min內(nèi)緩慢地滴定到前述混合物中。用2.5%的NH3·H2O調(diào)節(jié)溶液的pH值，使其在反應(yīng)過(guò)程中保持在10±0.5。完成滴定后，保溫繼續(xù)反應(yīng)24 h，然后在常溫下靜置陳化24 h，用去離子水洗滌至pH值約為7.0，最后將沉淀物過(guò)濾、冷凍干燥即得以上3組實(shí)驗(yàn)材料。

1.3 HE樣品和齲損的制備

據(jù)中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第920醫(yī)院的標(biāo)準(zhǔn)程序，收集因正畸而拔除的18～45歲人群的第三磨牙。選用完整并且沒(méi)有齲損的人牙，用刀片去除牙齒表面的有機(jī)污物并切下根部，再用DTQ-5低速精密切割機(jī)切成長(zhǎng)寬厚約為4 mm×3 mm×2 mm的釉質(zhì)塊，用PMMA包埋釉質(zhì)塊，在水冷金剛砂盤上將暴露的釉質(zhì)唇拋光為鏡面狀表面，用體視顯微鏡檢查無(wú)明顯劃痕。處理好的釉質(zhì)塊超聲處理1 min，浸入含有0.1 mol/L乳酸和3%羧甲基纖維素的乳酸脫礦凝膠中(pH=4.0)，使釉質(zhì)的表面積與溶液的比率為2 mm2/mL，置于37 ℃恒溫箱中進(jìn)行脫礦處理12 h，再用去離子水反復(fù)沖洗樣品并進(jìn)行超聲處理1 min，處理好的樣品儲(chǔ)存在4 ℃的PBS中備用。

1.4 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞毒性

采用CCK-8法，測(cè)定上述所制備材料對(duì)第3代293T細(xì)胞的毒性。制備濃度為0.05～0.4 g/mL的待測(cè)材料浸提液，與密度為5.0×104個(gè)/孔的293T細(xì)胞共同培養(yǎng)48 h，然后將10 μL CCK-8溶液加入到每個(gè)孔中，繼續(xù)溫育4 h，在波長(zhǎng)為450 nm下測(cè)量每個(gè)孔的光密度(OD)。相對(duì)細(xì)胞活性(RCV)按以下公式計(jì)算：

(1)

式中：ODt、ODn和OD0分別為含有材料浸提液的孔，不含材料的孔(陰性對(duì)照)和沒(méi)有細(xì)胞的孔(空白對(duì)照)的平均光密度值。每種濃度材料測(cè)量8個(gè)孔的OD值，使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

1.5 HE樣品表征

脫礦HE樣品的再礦化方法和流程與課題組已發(fā)表文章[23]相同。采用配備EDX能譜的FEI Nova NanoSEM 450型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡表征HE的表面和剖面形貌及表面元素組成。采用PANalytical Empyrean型X射線衍射儀測(cè)定HE表面成分結(jié)構(gòu)，測(cè)試條件為如下：Cu Kα(λ=0.154 06 nm)，掃描角度2θ=20°～70°，步長(zhǎng)0.02°，電流40 mA，電壓40 kV。采用THV-30MD型顯微硬度儀，測(cè)定9.8 N載荷下HE樣品表面顯微硬度(SMH)，保荷時(shí)間為15 s。測(cè)定3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(脫礦前MH0、脫礦后MH1和再礦化后MH2)，測(cè)量樣品表面間距200～300 μm的三個(gè)點(diǎn)并計(jì)算平均值。將HE樣品的SMH按從大到小排列，根據(jù)平衡分布原理將樣品均勻分為3組(n=6)。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合材料的細(xì)胞毒性分析

圖1為HA、Gly/GO/HA和Asp/GO/HA的細(xì)胞毒性對(duì)比圖。參照GB/T 16886.5—2017《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》，不含AA/GO的HA在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞毒性為0級(jí)或1級(jí)；Gly/GO/HA和Asp/GO/HA的細(xì)胞毒性均為0級(jí)。與劉繼濤等[23]制備的GO/HA復(fù)合材料相比，AA分子的引入顯著提高了復(fù)合材料的細(xì)胞相對(duì)活性(RCV)值，表明AA/GO復(fù)合改性HA具有較高的安全性和生物相容性。

圖1 復(fù)合材料對(duì)細(xì)胞相對(duì)活性的影響Fig.1 Effect of the composites on relative cells viability

2.2 HE表面形貌分析

圖2為再礦化前/后HE表面的FESEM照片。由圖2(a)可知，拋光HE表面密實(shí)完整。經(jīng)酸蝕處理后HE表面暴露出了部分的釉柱間隙，表面脫礦比較明顯(見圖2(b))。再礦化處理后，不含AA/GO的HA材料對(duì)酸蝕HE表面的修復(fù)作用有限，可以清晰地看出鱗片狀的釉柱形貌(見圖2(c))，從左下角的高倍FESEM照片可以看出，HE表面的空腔是HA利用納米顆粒的吸附性填充的，因此在釉質(zhì)表面形成了不太緊密的礦化層。圖2(d)為Gly/GO改性HA復(fù)合材料處理組，HE表面生成了致密的再礦化層，并且吸附了少量的棒狀晶體顆粒。圖2(e)為Asp/GO改性HA復(fù)合材料處理組，HE表面形成了不連續(xù)的再礦化層，從左下角的高倍放大圖可以看出，再生的晶體具有不規(guī)則的形狀。綜上可知，Gly/GO/HA對(duì)酸蝕HE表面的修復(fù)效果優(yōu)于HA和Asp/GO/HA。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能為：Gly的引入降低了HA晶體的穩(wěn)定性，使Gly/GO/HA再礦化溶液能提供更多鈣離子，促進(jìn)了酸蝕HE表面新的HA晶體生成，并促進(jìn)新生晶體沿有利于整體表面能降低的c軸有序生長(zhǎng)。同時(shí)，Gly/GO/HA中的GO片層具有豐富的含氧活性基團(tuán)，也可以有效促進(jìn)HA的成核和結(jié)晶。由于Asp帶負(fù)電，對(duì)HA表面的親和力較高，可能會(huì)抑制HA晶體的生長(zhǎng)。此外，含Asp的Asp/GO/HA顆粒由于缺少顯著的表面電荷，導(dǎo)致其混懸液的穩(wěn)定性較差，容易沉淀至再礦化溶液底部，使其對(duì)齲損HE表面的修復(fù)效果較差。

圖2 再礦化前/后HE表面的FESEM照片：(a)拋光；(b)酸蝕；(c)HA；(d)Gly/GO/HA；(e)Asp/GO/HAFig.2 Surface FESEM images of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) acid-etched; (c) HA; (d) Gly/GO/HA; (e) Asp/GO/HA

2.3 HE剖面形貌分析

圖3為再礦化前/后HE剖面的FESEM照片。由圖3(a)可知，拋光HE剖面較致密。經(jīng)酸蝕處理后，HE剖面暴露出約15 μm深的釉柱間隙，并且有更多的釉質(zhì)棱晶暴露出來(lái)，脫礦比較明顯(見圖3(b))。再礦化處理后，不含AA/GO的HA(見圖3(c))對(duì)酸蝕HE深層的修復(fù)作用有限，仍可清晰看到釉柱間隙和暴露的釉質(zhì)棱晶。Gly/GO/HA對(duì)HE深層脫礦的修復(fù)作用如圖3(d)所示，再礦化后HE的剖面完整致密，從高倍放大圖可以看出有大量細(xì)小的晶粒生成。結(jié)合圖2(d)可知，在Gly/GO的協(xié)同作用下，HA復(fù)合材料對(duì)酸蝕HE表面和深層脫礦均具有良好的修復(fù)作用。Asp/GO/HA處理組見圖3(e)，深層的脫礦區(qū)域仍有明顯的缺陷，高倍放大圖中可見許多釉質(zhì)棱晶暴露出來(lái)，說(shuō)明其對(duì)酸蝕HE深層的修復(fù)較差，進(jìn)一步驗(yàn)證了2.2中的分析。

圖3 再礦化前/后HE剖面FESEM照片：(a)拋光；(b)酸蝕；(c)HA；(d)Gly/GO/HA；(e)Asp/GO/HAFig.3 Cross-section FESEM images of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) acid-etched; (c) HA; (d) Gly/GO/HA; (e) Asp/GO/HA

2.4 HE表面元素分析

HE表面元素組成分析如表1和圖4所示。由圖4(a)可以看出，拋光的HE表面n(Ca)/n(P)為1.64(經(jīng)驗(yàn)衍生的HA為1.67)，說(shuō)明HE主要由結(jié)晶度良好的HA晶體組成。由圖4(b)可以看出，經(jīng)過(guò)12 h酸蝕處理后，HE表面n(Ca)/n(P)降為1.56，且Ca元素的占比有一定降低。由圖4(c)可知，再礦化處理后，不含AA/GO的HA使n(Ca)/n(P)恢復(fù)到1.61，這一結(jié)果可能更多反映了吸附在酸蝕HE表面的HA晶體的n(Ca)/n(P)。由圖4(d)和(e)可知，Gly/GO/HA和Asp/GO/HA使酸蝕HE表面的n(Ca)/n(P)分別恢復(fù)至1.59和1.57，均高于酸蝕處理后的n(Ca)/n(P)值(1.56)。說(shuō)明這兩種復(fù)合材料均對(duì)酸蝕HE有修復(fù)作用，前者的修復(fù)作用優(yōu)于后者，與前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。HE表面n(Ca)/n(P)摩爾比如表1所示。

表1 HE表面Ca/P摩爾比Table 1 Ca/P molar ratio of the human enamel surface

圖4 再礦化前/后HE表面EDS圖譜：(a)拋光；(b)酸蝕；(c)HA；(d)Gly/GO/HA；(e)Asp/GO/HAFig.4 Surface EDS patterns of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) acid-etched; (c) HA; (d) Gly/GO/HA; (e) Asp/GO/HA

2.5 HE表面成分結(jié)構(gòu)分析

圖5為再礦化前/后HE表面的XRD圖譜。圖5(a)為拋光HE，圖5(b)為酸蝕處理后的HE，可以看出酸蝕后釉質(zhì)表面的衍射峰明顯弱化，說(shuō)明酸蝕會(huì)顯著降低HE表面HA晶格的完整性。再礦化處理后，圖5(c)、(d)和(e)的晶面衍射峰均有不同程度的恢復(fù)，說(shuō)明酸蝕部位均得到了一定程度的修復(fù)。其中Gly/GO/HA處理組(見圖5(d))的衍射峰強(qiáng)度最接近拋光牙釉質(zhì)，表明Gly/GO/HA對(duì)HE表面晶體的修復(fù)作用優(yōu)于HA和Asp/GO/HA。

圖5 再礦化前/后HE表面XRD圖譜：(a)拋光；(b)酸蝕；(c)HA；(d)Gly/GO/HA；(e)Asp/GO/HAFig.5 Surface XRD patterns of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) acid-etched; (c) HA; (d) Gly/GO/HA; (e) Asp/GO/HA

2.6 HE表面力學(xué)性能分析

圖6為再礦化前/后HE的SMH圖。經(jīng)酸蝕處理后，HE的SMH均值從353.89 HV降低至約75 HV。通過(guò)單因素方差分析顯示，脫礦后各實(shí)驗(yàn)組樣品的SMH沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)。盡管三組材料均使酸蝕HE的SMH得到一定恢復(fù)，且彼此之間無(wú)顯著差異(p<0.05)，但仍遠(yuǎn)低于拋光HE，表明各組實(shí)驗(yàn)材料對(duì)HE的表面力學(xué)性能修復(fù)作用有限。HE精密的層級(jí)結(jié)構(gòu)和有機(jī)物賦予的獨(dú)特增韌機(jī)制[13]，使其具有高硬度、高韌性等特殊力學(xué)性能。經(jīng)酸蝕處理12 h后，HE的精密層級(jí)結(jié)構(gòu)可能已被酸蝕破壞，導(dǎo)致再礦化后HE的SMH難以恢復(fù)至正常水平。

圖6 再礦化前/后HE的SMH圖：(a)拋光；(b)HA；(c)Gly/GO/HA；(d)Asp/GO/HAFig.6 SMH of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) HA; (c) Gly/GO/HA; (d) Asp/GO/HA

3 結(jié) 論

(1)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Gly和Asp分別與GO復(fù)合改性HA，可顯著提高材料浸提液的相對(duì)細(xì)胞活性，說(shuō)明Gly/GO/HA和Asp/GO/HA具有較高的安全性和生物相容性。

(2)經(jīng)Gly/GO/HA處理后，酸蝕HE表面及深層脫礦均得到良好修復(fù)。Gly的引入使HA沿c軸有序生長(zhǎng)，GO片層上附著的豐富的含氧活性基團(tuán)，進(jìn)一步促進(jìn)了HA的成核和結(jié)晶。Asp/GO/HA的再礦化效果較弱，帶負(fù)電的Asp對(duì)HA表面親和力較高，可能會(huì)抑制HA晶體的生長(zhǎng)。此外，含有Asp的HA顆粒不易形成穩(wěn)定的混懸液，使Asp/GO/HA無(wú)法有效修復(fù)酸蝕HE。

(3)HE表面元素、成分結(jié)構(gòu)分析表明，Gly/GO/HA對(duì)酸蝕HE表面的修復(fù)作用優(yōu)于Asp/GO/HA和HA。力學(xué)性能分析表明，各組材料對(duì)酸蝕HE的表面顯微硬度修復(fù)作用有限，可能是由于新生成的礦物層缺少HE原有的精密層級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)其SMH值的恢復(fù)造成了一定的影響。