復(fù)合益生素對熱應(yīng)激肉雞腸道功能的影響

■李相安 鄒本革 王 政 王文博

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東 煙臺 265200；2.青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司，山東 青島 266000）

白羽肉雞代謝能力強(qiáng)、產(chǎn)熱多，散熱能力弱，養(yǎng)殖密度大，過度依賴設(shè)備通風(fēng)散熱[1-2]，夏季散熱不充分容易導(dǎo)致熱應(yīng)激，是現(xiàn)代白羽肉雞養(yǎng)殖損失的主要原因之一[3-5]。

發(fā)生熱應(yīng)激時(shí)，肉雞血液動(dòng)員至呼吸、表皮系統(tǒng)參與散熱，相應(yīng)其他組織血量減少，長期導(dǎo)致組織缺血，對于消化系統(tǒng)來說，主要引起腸道內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接破壞，引起腸道屏障功能減弱[6-7]，進(jìn)而出現(xiàn)大分子通透性增加，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[8]，最終導(dǎo)致機(jī)體過度消耗出現(xiàn)其他癥狀甚至死亡，造成養(yǎng)殖損失。

緩解熱應(yīng)激的方法分內(nèi)外調(diào)節(jié)兩種：外部調(diào)劑主要包括畜舍設(shè)計(jì)、通風(fēng)、灑水、遮蔽等，通過降低環(huán)境溫度或提高散熱效率來減少環(huán)境熱影響；內(nèi)部調(diào)節(jié)有飼料配方和飼料添加劑兩種，飼料配方調(diào)節(jié)主要是降低粗蛋白含量，減少消化產(chǎn)熱；文獻(xiàn)報(bào)道可見的緩解熱應(yīng)激的飼料添加劑有益生素[9-11]、抗生素、抗氧化劑、維生素、礦物質(zhì)、益生素、精油等。

其中益生素緩解熱應(yīng)激的機(jī)理研究較少，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為益生素從下調(diào)致炎因子表達(dá)、改善腸道屏障功能[12]以及緩解宿主氧化應(yīng)激[13]等幾個(gè)方面緩解熱應(yīng)激的副作用，從而提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。

采食量、生產(chǎn)性能是養(yǎng)殖現(xiàn)場對熱應(yīng)激損傷的重要評價(jià)指標(biāo)；上皮細(xì)胞緊密連接、黏液素mRNA 相對表達(dá)水平能側(cè)面反映腸道損傷情況；腸黏膜致炎因子、抑炎因子、Toll樣受體和核因子κB（NF-κB）mRNA相對表達(dá)水平可以反饋熱應(yīng)激狀況對腸道的影響；而血清抗氧化指標(biāo)水平和熱休克蛋白70（HSP70）mRNA相對表達(dá)水平可以反映熱損傷后修復(fù)情況。

熱應(yīng)激條件下益生素對動(dòng)物生產(chǎn)性能、腸道屏障功能及抗氧化能力的影響的綜合數(shù)據(jù)少見報(bào)道。因此本試驗(yàn)選取復(fù)合益生菌作為熱應(yīng)激修復(fù)劑，以基礎(chǔ)日糧為對照組，觀察益生素在熱應(yīng)激條件下對白羽肉雞生產(chǎn)性能、腸道屏障及有益微生物豐度、炎癥反應(yīng)、熱應(yīng)激修復(fù)等幾個(gè)方面的影響，為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用復(fù)合益生素制劑1（地衣芽孢桿菌1.31×1010CFU/g、凝結(jié)芽孢桿菌1.80×1010CFU/g）、復(fù)合益生素制劑2（凝結(jié)芽孢桿菌1.80×1010CFU/g、酪酸菌2.45×108CFU/g）和復(fù)合益生素制劑3（地衣芽孢桿菌1.31×1010CFU/g、凝結(jié)芽孢桿菌1.80×1010CFU/g、酪酸菌2.45×108CFU/g）由青島某生物公司提供。試驗(yàn)所用白羽肉雞（ROSS）來自于當(dāng)?shù)剞r(nóng)場（山東青島）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年11月在青島根源研發(fā)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，1日齡白羽肉雞240羽，分為4個(gè)處理組：對照組、益生素1組、益生素2組和益生素3組。

每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20羽，公母各半，自由采食和飲水。1 日齡環(huán)境溫度（35.0±1.1）℃、相對濕度（65±5）%，之后每周降低2.8 ℃，21 日齡達(dá)26.7 ℃、相對濕度（65±5）%。22 日齡開始熱應(yīng)激處理：每天9：00～17：00 熱風(fēng)爐調(diào)節(jié)至環(huán)境溫度為35 ℃、相對濕度75%；17:00～次日9：00 自然通風(fēng)，至42日齡試驗(yàn)結(jié)束。

試驗(yàn)結(jié)束統(tǒng)計(jì)各處理組生產(chǎn)性能，并且每個(gè)處理組隨機(jī)選取6 羽雞屠宰采樣分析。所有試驗(yàn)操作在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行。

1.3 日糧組成及營養(yǎng)水平

試驗(yàn)所用飼料參考NRC（1998）肉用仔雞的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，基22～42日齡基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗(yàn)分組

表2 試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.4 飼養(yǎng)管理及生產(chǎn)性能記錄

每日8：00、14：00分別記錄環(huán)境溫度和濕度。每周統(tǒng)計(jì)耗料，同時(shí)進(jìn)行稱重，計(jì)算平均日采食量、死淘率、平均體重和料重比。

1.5 樣品采集及測定指標(biāo)

各組隨機(jī)選取6羽白羽肉雞頸動(dòng)脈放血屠宰，取空腸中段，刮取內(nèi)側(cè)黏膜檢測腸黏膜致炎因子、抑炎因子等；另取盲腸腸道內(nèi)容物用于腸道有益微生物豐度分析；并另取一段空腸樣品，用無菌生理鹽水沖凈后用液氮冷凍并保存于-80 ℃以測定上皮細(xì)胞緊密連接、黏液素和HSP70 mRNA相對表達(dá)水平。

1.5.1 DNA提取和測序

采用腸道內(nèi)容物基因組DNA提取試劑盒提取各組肉仔雞盲腸內(nèi)容物微生物總DNA，每組高通量測序樣本數(shù)為6個(gè)。按指定測序區(qū)域（16S rDNA V3～V4區(qū)）合成帶有barcode 的特異性引物，構(gòu)建Illumina PE250文庫后上機(jī)，由上海凌恩生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序。利用Illumina PE250 平臺測序得到的PE reads 根據(jù)overlap 關(guān)系進(jìn)行拼接，并對序列質(zhì)量進(jìn)行品控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行操作分類單元（OTU）聚類分析和物種分類學(xué)分析?；诜诸悓W(xué)信息，在各分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.5.2 血清抗氧化指標(biāo)測定

頸動(dòng)脈放血，4 ℃留置，析出血清檢測超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化酶（CAT）和丙二醛（MDA）含量（上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司，上海）。

1.5.3 mRNA相對表達(dá)水平測定

試劑盒提取空腸黏膜或空腸樣品總RNA（RNA Extraction Kit，TakaRa），免疫因子引物序列如表3所示。

表3 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 軟件初步處理后，利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長性能（見表4）

如表4 所示，各益生素組均重、平均日采食量均高于對照組（P＞0.05）。除益生素2 組外，各益生素組的死淘率、料重比均低于對照組（P＞0.05）。

表4 熱應(yīng)激對各處理組白羽肉雞生長性能的影響

2.2 腸道屏障（見表5、表6）

表6 熱應(yīng)激對各處理組白羽肉雞空腸樣品黏液素mRNA相對表達(dá)水平的影響

由表5 可知，益生素組ZO-1 mRNA 相對于對照組顯著降低（P＜0.05），且益生素各組E-cadherin 和Occlaudin mRNA 相對表達(dá)水平平均值低于對照組（P＞0.05），表明受熱應(yīng)激影響，對照組緊密連接蛋白E-cadherin、Occlaudin 和ZO-1 mRNA 相對表達(dá)水平升高，而3種復(fù)合益生素都能有效緩解由于熱應(yīng)激造成的雞腸道緊密連接蛋白的劇烈變化。

表5 熱應(yīng)激對各處理組白羽肉雞空腸樣品緊密連接蛋白mRNA相對表達(dá)水平的影響

由表6 可知，3 個(gè)益生素組MUC-2 和MUC-5ac mRNA 相對表達(dá)水平顯著低于對照組（P＜0.05），表明受熱應(yīng)激影響，對照組MUC-2 和MUC-5ac mRNA 相對表達(dá)水平升高，而3種復(fù)合益生素都能有效緩解由于熱應(yīng)激造成的雞腸道上皮細(xì)胞黏液素分泌的劇烈變化。

2.3 炎癥反應(yīng)及有益微生物豐度（見表7～表10）

表7 熱應(yīng)激對各處理組白羽肉雞空腸黏膜致炎因子mRNA相對表達(dá)水平的影響

表8 熱應(yīng)激對各處理組白羽肉雞空腸黏膜抑炎因子mRNA相對表達(dá)水平的影響

表9 熱應(yīng)激對各處理組白羽肉雞空腸黏膜Toll樣受體及NF-κB mRNA相對表達(dá)水平的影響

表10 熱應(yīng)激對各處理組白羽肉雞腸道食糜乳酸菌及大腸桿菌-志賀氏菌屬豐度的影響（%）

益生素組iNOS mRNA的相對表達(dá)水平顯著低于對照組（P＜0.05），各組之間致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA相對表達(dá)水平無顯著性差異（P＞0.05），益生素組mRNA 相對表達(dá)水平均值低于對照組（表7），表明復(fù)合益生素能夠降低熱應(yīng)激條件下白羽肉雞腸道黏膜中致炎因子相對表達(dá)水平。

益生素1、2 組各抑炎因子相對表達(dá)水平均低于對照組，益生素3 組IL-10 mRNA 相對表達(dá)水平與對照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05），表明復(fù)合益生素能降低熱應(yīng)激條件下白羽肉雞腸道黏膜中致炎因子和抑炎因子mRNA相對表達(dá)水平。

益生素組NF-κB 相對表達(dá)水平顯著低于對照組（P＜0.05）；益生素組TLR-5 mRNA相對表達(dá)水平顯著低于對照組（P＜0.05）。3個(gè)益生素組乳酸桿菌豐度顯著高于對照組（P＜0.05），而大腸桿菌-志賀氏菌屬豐度顯著低于對照組（P＜0.05）（見表10），表明益生素的添加改善了白羽肉雞腸道有益微生物豐度。

2.4 熱應(yīng)激修復(fù)（見表11、表12）

表11 熱應(yīng)激對各處理組白羽肉雞空腸樣品熱應(yīng)激蛋白mRNA相對表達(dá)水平的影響

表12 熱應(yīng)激對各處理組白羽肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

益生素組HSP70 mRNA 相對表達(dá)水平平均值高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。益生素2 組HSP90 mRNA 相對表達(dá)水平顯著高于其他各組（P＜0.05）。益生素組血清抗氧化指標(biāo)SOD、GSH-Px、TAOC 水平顯著高于對照組（P＜0.05），MDA 水平低于對照組。本試驗(yàn)中益生素2 組和益生素3 組MDA 水平顯著低于對照組，益生素1組MDA水平與對照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05），但是平均值低于對照組，表明益生素提高了白羽肉雞的抗氧化能力。

3 討論

高溫季節(jié)肉雞發(fā)生熱應(yīng)激表現(xiàn)為采食量減少[14]、飼料利用率低[15-16]等，是養(yǎng)殖損失的重要原因之一。熱應(yīng)激時(shí)血液優(yōu)先供應(yīng)皮膚及呼吸系統(tǒng)散熱，導(dǎo)致其他器官血液供應(yīng)不足。熱應(yīng)激誘發(fā)腸道損傷的機(jī)理一般認(rèn)為是缺血[17-18]引起腸壁細(xì)胞通透性、緊密連接破壞，導(dǎo)致腸道屏障破壞，外源物質(zhì)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)誘發(fā)炎癥[19-20]，進(jìn)一步影響代謝及動(dòng)物健康。

生產(chǎn)性能方面，熱應(yīng)激狀況下肉雞機(jī)體調(diào)動(dòng)能量降溫，表現(xiàn)為食欲下降，料重比升高，這一點(diǎn)從采食量、均重、料重比等方面數(shù)據(jù)有體現(xiàn)；本試驗(yàn)結(jié)果表明益生菌對熱應(yīng)激后的動(dòng)物生產(chǎn)性能有提高作用，與Parisa 等[21]、Sun 等[22]報(bào)道相符合，驗(yàn)證了復(fù)合益生素有助于提高熱應(yīng)激狀況下白羽肉雞的均重；本試驗(yàn)益生素組體重增加較大，所以料重比與對照組相比差異不大。

在熱應(yīng)激缺血導(dǎo)致腸道細(xì)胞旁通透性增加、屏障破壞[23-26]，本試驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)合益生素降低白羽肉雞空腸緊密連接蛋白、黏液素mRNA 的相對表達(dá)水平，該結(jié)果與Zhang等[12]報(bào)道存在不一致。Soheil等[20]認(rèn)為E-cadherin、Claudin-5 和ZO-1 mRNA 表達(dá)水平顯著升高，是因?yàn)镃adherins 蛋白表達(dá)水平降低后宿主產(chǎn)生的補(bǔ)償效應(yīng)。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果分析認(rèn)為對照組緊密連接蛋白和黏液素mRNA相對表達(dá)水平升高，反映出對照組的熱應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)較為劇烈，復(fù)合益生素則有效維護(hù)了腸道屏障功能。另外添加益生素能有效地改善腸道有益微生物豐度，為動(dòng)物腸道屏障增加一層保護(hù)。

本試驗(yàn)熱應(yīng)激條件下益生素組致炎因子mRNA相對表達(dá)水平降低，而且抑炎因子mRNA相對表達(dá)水平降低，表明復(fù)合益生素不僅降低了致炎因子mRNA的相對表達(dá)水平，同時(shí)維持了腸道致炎因子和抑炎因子之間的平衡[10-11，23]。

試驗(yàn)中3 個(gè)益生素組HSP70 mRNA 相對表達(dá)水平平均值高于對照組（P＞0.05）、血清抗氧化指標(biāo)均優(yōu)于對照組（P＜0.05），表明飼料中添加3 種復(fù)合益生素緩解了由熱應(yīng)激造成的動(dòng)物機(jī)體氧化損傷[10-11，23]，且機(jī)體修復(fù)能力[27-29]優(yōu)于對照組。

綜上所述，復(fù)合益生素有效緩解了由熱應(yīng)激導(dǎo)致的屏障功能損傷、腸道炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，有利于提高白羽肉雞的均重。無論是熱應(yīng)激還是病理應(yīng)激，首先受到影響的是動(dòng)物的腸道屏障，繼而免疫功能被激活并造成生產(chǎn)性能下降，因此增強(qiáng)動(dòng)物腸道屏障的防御能力，減少動(dòng)物感染的概率是后抗生素時(shí)代保障動(dòng)物生產(chǎn)性能的前提條件。本研究結(jié)果可為日糧調(diào)控改善高溫條件下雞群的腸道健康及保障肉雞的生長提供參考，具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。