健脾補肺化痰方對幼齡哮喘大鼠肺組織形態(tài)學(xué)光鏡下的影響

余燕玲+邊遜+尚莉麗+田凈憶

摘要：目的 研究健脾補肺化痰方對幼齡哮喘大鼠肺組織形態(tài)學(xué)光鏡下的影響。方法 取清潔級幼齡雄性SD大鼠120只（體重控制95±5 g），隨機分為正常組：4 w、8 w、12 w，模型組：4 w、8 w、12 w，健脾補肺化痰方中藥組（簡稱中藥組）：4 w、8 w、12 w及地塞米松西藥組（簡稱西藥組）：4 w、8 w、12 w，共12組，每組10只。采用第1 d及第8 d腹腔注射OVA（100mg）+Al（OH）3凝膠（100 mg）混合液1 ml/鼠致敏，第15 d卵蛋白溶液霧化激發(fā)哮喘，第16 d開始分別給予不同藥物治療，按時間節(jié)點不同，各組分別按照4 w、8 w、12 w后處死大鼠，HE染色后光鏡下觀察各組的肺組織形態(tài)學(xué)的情況。結(jié)果 正常組大鼠肺組織HE病理變化不明顯，模型組肺組織切片顯示支氣管管腔狹窄，黏膜上皮破損及黏膜下膠原沉積，基底膜明顯增厚且不規(guī)則，支氣管管壁各層均有炎性細(xì)胞浸潤，隨激發(fā)時間的越長越明顯；健脾補肺化痰方4 w組的大鼠支氣管壁周圍有少量EOS、淋巴細(xì)胞浸潤、氣道平滑肌增厚稍增厚，伴粘液分泌，基底膜稍增厚；健脾補肺化痰方12 w組與8 w組相比，氣道平滑肌相對增厚，管腔相對狹窄。地塞米松組肺組HE病理改變與模型組相比較明顯減輕，但未完全消失。

結(jié)論 健脾補肺化痰方能抑制炎癥反應(yīng)，降低氣道高反應(yīng)性，有效防治氣道重塑。

關(guān)鍵詞：小兒哮喘；幼齡大鼠；肺組織形態(tài)

中圖分類號：R285.5 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）14-0050-03

Effect of Jianpi Bufei Huatan Decoction on Morphology of Lung Tissue in Young Asthmatic Rats

YU Yan-ling1，BIAN Xun1，SHANG Li-li2，TIAN Jing-yi3

（1.Nanjing Traditional Chinese and Western Medicine Hospital，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210014，Jiangsu，China；

2.Anhui Traditional Chinese Medicine Hospital，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230031，Anhui，China）

Abstract：Objective To study the effects of Jianpi Huatan Decoction on pulmonary morphology under light microscopy of lung tissue of young rats with asthma.Methods The clean level of young male 120 SD rats（weight control 95±5 g），were randomly divided into normal group：4w，8w，12w，model group：4w，8w，12w，Jianpi Bufei Huatan formula of Chinese medicine group（traditional Chinese medicine group）：4w，8w，12w，and dexamethasone in western medicine group（referred to as the western medicine group）：4w，8w，12w，a total of 12 groups，10 rats in each group.1 ml/rats were sensitized by intraperitoneal injection of OVA（100mg）Al（OH）3 gel（100 mg）intraperitoneally for first and 8 days，the fifteenth d ova inhalation asthma， the sixteenth d were given different drugs， according to different time，they were in accordance with the 4w， 8w，12 w，the rats were killed after treatment，HE staining of lung tissue morphology observed under light microscope.Results In the normal group，the lung tissue of HE rats without pathological changes obviously， the model group lung tissue sections showed bronchial stenosis，collagen deposition and submucosal epithelial damage，basement membrane thickened and irregular bronchial wall layers were inflammatory cell infiltration，the excitation with the longer the more obvious；Jianpi Bufei Huatan formula with a small amount of EOS，around 4w group of bronchial wall rat lymphocyte infiltration，airway smooth muscle thickening slightly thickened，with mucus secretion，basement membrane thickening slightly；Jianpi Bufei Huatan formula 12w group compared with 8w，the relative airway smooth muscle thickening，lumen is relatively narrow.Dexamethasone group HE pathological changes compared with the model group was significantly reduced，but not completely disappear.Conclusion Jianpi Bufei Huatan Decoction can inhibit the inflammatory reaction，reduce airway hyperresponsiveness，and effectively prevent airway remodeling.

Key words：Pediatric asthma；Young rats；Lung tissue morphology

最新的兒童哮喘國際共識將哮喘定義簡化為哮喘是與多變的氣流阻塞和支氣管高反應(yīng)性相關(guān)的慢性炎癥病變，癥狀表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、氣促和胸悶[1]。有學(xué)者通過整理我國近30年關(guān)于兒童哮喘的流行病學(xué)文獻和研究發(fā)現(xiàn)，0～14歲兒童哮喘患病率呈上升趨勢，且造成這種上升趨勢的原因與空氣質(zhì)量、生活條件和醫(yī)療條件關(guān)系密切[2]。因此，兒童哮喘的防治刻不容緩。健脾補肺化痰方是導(dǎo)師多年來用于防治兒童支氣管哮喘的經(jīng)驗方，本課題通過實驗研究觀察該方對幼齡哮喘大鼠的肺組織形態(tài)學(xué)光鏡下的影響，探討健脾補肺化痰方通過干預(yù)哮喘患兒氣道重塑發(fā)生的作用機理，進一步驗證該方對哮喘治療的有效性。

1材料與方法

1.1實驗材料

120只清潔級雄性幼齡大鼠（體重95±5g），由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。主要試劑及藥品：卵白蛋白（OVA），生理鹽水，3%戊巴比妥；健脾補肺化痰方由南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 取清潔級幼齡雄性SD大鼠120只（體重控制95±5 g），由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。隨機分為正常組：4 w、8 w、12 w，模型組：4 w、8 w、12 w，健脾補肺化痰方中藥組（簡稱中藥組）：4 w、8 w、12 w及地塞米松西藥組（簡稱西藥組）：4 w、8 w、12 w，共12組，每組10只。

1.2.2實驗方法 參照參考文獻 [3]復(fù)制大鼠哮喘模型，哮喘各組分別在第1 d和第8 d腹腔注射OVA（100mg）+Al（OH）3 （100 mg）混合液1 ml/鼠致敏，第15 d起以1%OVA霧化激發(fā)，30 min/次，并隔天1次，以大鼠出現(xiàn)呼吸急促，腹肌抽搐，口唇發(fā)紺、站立不穩(wěn)代表模型復(fù)制成功。正常組參照上述方法，只是致敏與激發(fā)時均以生理鹽水代替致敏液。同時，Z4、M4、J4、D4組霧化激發(fā)4 w，Z8、M8、J8、D8組霧化激發(fā)8 w，Z12、M12、J12、D12組霧化激發(fā)12 w。給藥劑量參考魏偉主編的《藥理實驗方法學(xué)》[4]列出人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值。造模后第16 d開始給藥，健脾補肺化痰方、地塞米松給藥劑量取中等劑量，相當(dāng)于成人日常治療量的5倍，灌胃給藥（容積為25 ml/kg），正常組、模型組灌胃等體積的9.0 g/L氯化鈉溶液，1次/d，每組中再分別對應(yīng)連續(xù)灌胃4 w、8 w、12 w。各組大鼠分別于霧化吸入的第4 w、8 w、12 w，最后一霧化激發(fā)24 h內(nèi)，用2%戊巴比妥（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉后處死，打開胸腔，取靠近右肺門處切取肺組織100 mg（大小約3 mm×3 mm×3 mm），浸入4%多聚甲醛中固定4～6 h，轉(zhuǎn)入70%乙醇，送病理科進行石蠟包埋。取石蠟包埋后的組織塊常規(guī)切片（厚度約為4 μm）用于染色。60 ℃恒溫烤箱中烤片，熔蠟1 h；二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各15 min；先后放入100%酒精Ⅰ5 min/ Ⅱ2 min，90%酒精2 min，80%酒精2 min，70%酒精2 min脫水；后用蒸餾水沖洗2 min；將細(xì)胞核蘇木精染色15 min左右染成藍色后自來水洗去浮色；分色數(shù)秒；用自來水沖洗15～20 min左右藍化；細(xì)胞質(zhì)伊紅染色2 min左右成紅色；分色： 鏡下控制95%酒精分色1 min；先后放入95%酒精5 min，100%酒精110 min，100%酒精210 min脫水；入二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min透明；用中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0軟件行單因素方差分析及相關(guān)性分析，所有計量資料實驗數(shù)據(jù)以（x±s）表示，P<0.05為具有顯著性差異；P<0.01為具有非常顯著性差異。

2結(jié)果

正常組大鼠肺組織HE病理變化不明顯，支氣管管腔規(guī)則，黏膜上皮及黏膜肌層完整，氣管平滑肌未見增厚，周圍無炎性細(xì)胞浸潤，肺泡形態(tài)較規(guī)則；模型組肺組織切片顯示支氣管管腔狹窄，黏膜上皮破損及黏膜下膠原沉積，基底膜明顯增厚且不規(guī)則，支氣管管壁各層均有嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，部分管腔內(nèi)可見黏液栓且肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，隨激發(fā)時間的不斷延長，模型組大鼠可見支氣管壁明顯增厚，基底膜明顯增厚且不規(guī)則，支氣管平滑肌肥大加重，管腔狹窄明顯等；健脾補肺化痰方4 w組的大鼠支氣管壁周圍有少量EOS、淋巴細(xì)胞浸潤、氣道平滑肌增厚稍增厚，伴粘液分泌，基底膜稍增厚；健脾補肺化痰方12 w組與8 w組相比，氣道平滑肌相對增厚，管腔相對狹窄。地塞米松組肺組HE病理改變與模型組相比較明顯減輕，但未完全消失。光鏡下觀察哮喘各組大鼠肺組織HE圖像，見圖1。

3討論

1922年Huber和Koessler首先提出“氣道重塑”的概念，他們發(fā)現(xiàn)死亡的哮喘患者的氣道腔會出現(xiàn)嚴(yán)重狹窄，并伴有粘膜肥厚、氣道壁增厚及炎癥細(xì)胞的浸潤等。近年來，許多病理學(xué)和形態(tài)學(xué)的研究證實哮喘患者氣道結(jié)構(gòu)的變化不僅存在于重型哮喘中，而輕型哮喘中也存在不同程度的上述的病理改變，氣道結(jié)構(gòu)一系列的改變，尤其是氣道壁的增厚導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性增加，同時改變平滑肌收縮的程度使管腔進一步狹窄，另外上皮下膠原的沉積使氣道壁粘膜的僵硬度較外側(cè)的增加[5]。

氣道重塑是哮喘的主要病理學(xué)特征之一，也是哮喘遷延難愈的重要環(huán)節(jié)。到目前為止，關(guān)于氣道重塑都認(rèn)為是由多種炎性細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道損傷修復(fù)且反復(fù)刺激的過程。中醫(yī)治療哮喘應(yīng)遵循“急則治標(biāo)，緩則治本”的原則，多靶點、多途徑的整體治療引起哮喘的氣道慢性炎癥，且降低AHR具有明顯優(yōu)勢。哮喘發(fā)生時，機體內(nèi)各種炎性細(xì)胞、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)相互作用及免疫調(diào)節(jié)的紊亂使其處于高反應(yīng)狀態(tài)，氣道局部則發(fā)生相關(guān)病理改變?，F(xiàn)在有研究表明，麻芍平喘湯可抑制IL-5、IL-13活性，均有抑制炎細(xì)胞浸潤，緩解大鼠氣道炎癥，修復(fù)破壞的氣道結(jié)構(gòu)，從而改善氣道重塑[6]；補肺益腎方可減少哮喘豚鼠肺內(nèi)IL-5含量，降低EOS活性，加速EOS凋亡，從而減輕氣道炎癥，抑制氣道重塑[7]；小青龍湯能有效降低TGF-β1Smad蛋白在哮喘大鼠肺組織中的表達，延緩氣道重塑[8]。

依據(jù)“急則治標(biāo)，緩則治本”的原則，在發(fā)作期攻邪治標(biāo)，祛痰降氣，緩解期扶正固本。治喘治標(biāo)不難，但哮除根不易，若僅僅滿足發(fā)作期的治療，易致哮喘的反復(fù)發(fā)作而得不到有效控制，所以控制哮喘的關(guān)鍵是要抓住緩解期的治療。小兒生理特點為“肺常不足”，“脾常虛”，而處在生長發(fā)育階段的小兒腎氣在不斷充實，故腎虛者少見，治療側(cè)重健脾且益肺。根據(jù)“培土生金”及“治痰先治氣”理論，并與現(xiàn)代藥理研究成果，結(jié)合多年的臨床實踐，研制出健脾補肺化痰方，該方具有健脾肺氣、化痰之功效。本實驗研究該方能減輕BA大鼠的支氣管壁炎癥，減輕氣道壁的增厚及纖維化，降低氣道高反應(yīng)性，有效防治氣道重塑。

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編輯/李樺