款冬花散對(duì)支氣管擴(kuò)張癥痰熱蘊(yùn)肺證模型大鼠氣道炎癥的影響

鐘云青，王秀峰，但曉霞，楊樹棟，王 麗

(1.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

支氣管擴(kuò)張癥由各種原因引起的支氣管樹的病理性、永久性擴(kuò)張，導(dǎo)致反復(fù)發(fā)生化膿性感染的一種常見的氣道炎癥性疾病，可嚴(yán)重?fù)p害患者肺組織和肺功能，影響患者的生活質(zhì)量[1]。臨床表現(xiàn)為慢性咳嗽、大量咳痰、間斷咯血，伴或不伴氣促和呼吸衰竭。支氣管擴(kuò)張癥在亞洲人群中屬于常見病，我國(guó)支氣管擴(kuò)張癥的患病率可能遠(yuǎn)高于歐美國(guó)家。一項(xiàng)國(guó)內(nèi)研究對(duì)7省市城區(qū)40歲以上居民進(jìn)行電話調(diào)研，結(jié)果提示有1.2%的居民曾被診斷為支氣管擴(kuò)張癥，該病的患病率隨著年齡增加而提高[2]。感染是支氣管擴(kuò)張癥最常見原因，是促使病情進(jìn)展和影響預(yù)后的最主要因素。感染引起支氣管管腔內(nèi)中性粒細(xì)胞募集及支氣管壁和肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并激活、釋放白三烯B4(Leukotriene B4，LTB4)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)及白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)等多種炎癥因子，形成氣道炎癥，氣道炎癥是支氣管擴(kuò)張癥的重要病理生理特征[3]。持續(xù)的氣道炎癥導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)破壞和氣道重塑，進(jìn)一步影響氣道分泌物排出，如此循環(huán)往復(fù)，導(dǎo)致支氣管永久性病理性擴(kuò)張。

按支氣管擴(kuò)張癥發(fā)展的不同程度和階段，將其歸入中醫(yī)“咳嗽”“肺癰”“咯血”等范疇，現(xiàn)今命名為“肺絡(luò)張”。該病的病機(jī)復(fù)雜，文獻(xiàn)顯示，痰熱蘊(yùn)肺證為支氣管擴(kuò)張癥最常見中醫(yī)證型[4-6]。本實(shí)驗(yàn)通過建立支氣管擴(kuò)張癥大鼠模型，選擇清熱化痰方款冬花散作為干預(yù)措施，研究款冬花散對(duì)支氣管擴(kuò)張癥痰熱蘊(yùn)肺證模型大鼠氣道炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠70只，體重200～230 g，購(gòu)買自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0004。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：款冬花散(款冬花 15 g，炙麻黃、浙貝、桑白皮、紫菀、旋覆花、白術(shù)各10 g，生石膏 30 g，前胡 12 g，甘草 6 g)。購(gòu)自北京同仁堂醫(yī)藥藥材有限公司，煎劑由中藥制劑室制作，先將中藥用500 ml清水浸泡1 h，再經(jīng)煎藥機(jī)煎1 h，煎成200 ml/劑，再經(jīng)-70 ℃制成凍干粉，封存于-20 ℃冰箱中備用。在實(shí)驗(yàn)前用0.9%氯化鈉水溶液按1 g生藥/ml配制備用。羅紅霉素膠囊(江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H10970291)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：綠膿桿菌(由南寧天地楊生物科技有限公司培養(yǎng))，蘇木素(批號(hào)：H9627，Sigma公司)，伊紅Y(水溶性)(批號(hào)：71014544，國(guó)藥集團(tuán))。大鼠LTB4 ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：CK-E30427R)，大鼠TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：CK-E30635R)，大鼠IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：CK-E30651R)，大鼠IL-8 ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：CK-E30583R)均由蘇州卡爾文生物技術(shù)有限公司提供。TRIzol(批號(hào)：182805，上海索寶生物科技有限公司)，純化試劑盒(批號(hào)：DP204-02，天根生物科技公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：K1632，Thermo Fisher scientific公司)，熒光定量試劑盒(批號(hào)：RR820A，TaKaRa公司)。

RM2066轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-RAD公司)，GeneAmp 9700PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)，StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(美國(guó)ABI公司)，5810R高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppenndorf公司)，超微量分光光度儀(美國(guó)Thermo公司)，DMI8倒置顯微鏡(德國(guó)徠卡公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物造模、分組及給藥：將70只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、款冬花散自身對(duì)照組、模型組、羅紅霉素組、款冬花散低、中、高劑量組，每組各10只。各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，空白對(duì)照組和款冬花散自身對(duì)照組正常飼養(yǎng)，其余五組參照萬毅剛等[7]造模方法建立支氣管擴(kuò)張癥大鼠模型：以4 %戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，選擇唇下3 cm處，常規(guī)消毒，做縱向1 cm切口，暴露頸部肌群，縱向分離出氣管。選擇環(huán)狀軟骨下較寬的氣管軟骨間隙做2 mm的橫向切口，將自制氣管插管微向右緩慢伸至胸骨角下約3 cm處，出現(xiàn)抵觸感，即右肺中下葉。以微量進(jìn)樣器從插管中快速注入0.02 ml 105CFU/L綠膿桿菌液和1 ml氣體。迅速拔出插管并保持大鼠垂直體位，待大鼠呼吸平穩(wěn)后縫合氣管切口、頸部肌群及皮膚。每只大鼠每天予青霉素G 1萬U腹腔注射，連續(xù)3 d，以防傷口感染。

由于造模過程中存在大鼠死亡，造模后各組大鼠的數(shù)量分別為：空白組(8只)、款冬花散自身對(duì)照組(8只)、模型組(10只)、羅紅霉素組(8只)、款冬花散低劑量組(9只)、款冬花散中劑量組(8只)和款冬花散高劑量組(10只)。自造模第3周后第1天起開始灌胃干預(yù)，羅紅霉素組給予羅紅霉素5 mg/(kg·d)灌胃，參照人與大鼠臨床等效劑量換算方法[8]款冬花散低、中、高劑量組分別給予款冬花散5.57、11.14、22.28 ml/(kg·d)，款冬花散自身對(duì)照組給予款冬花散22.28 ml/(kg·d)灌胃，空白組及模型組分別給予22.28 ml/(kg·d) 0.9%氯化鈉水溶液灌胃，連續(xù)給藥2周。

1.2.2 標(biāo)本采集：末次給藥后各組大鼠禁食12 h，以4 %戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，用止血鉗夾閉右下肺近肺門處，取下各組大鼠右下肺，PBS漂洗后，一部分固定于4 %多聚甲醛緩沖液用于病理學(xué)形態(tài)觀察，一部分放入液氮中保存以備提取RNA測(cè)定。以止血鉗夾閉左側(cè)肺門，插入鈍鋼針頭行右肺支氣管肺泡灌洗，用5 ml注射器注入2 ml無菌0.9%氯化鈉水溶液，保留2 min后緩慢回抽，回收肺泡灌洗液(BALF)原液，反復(fù)灌入3次，收集于10 ml滅菌離心管中。將BALF原液4 ℃、4000 r/min、離心半徑9.5 cm，離心5 min后，取其上清液分裝于EP管中，-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.3 大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察：取經(jīng)4%多聚甲醛固定后的大鼠肺組織，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片，然后進(jìn)行二甲苯脫蠟、無水乙醇脫水、蘇木素-伊紅染色、中性樹膠封片，鏡下觀察各組大鼠支氣管與肺組織形態(tài)學(xué)改變。

1.2.4 各組大鼠BALF中LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10含量檢測(cè)：取各組分裝的BALF，采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠LTB4、TNF-α、IL-8、IL-10含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 肺組織LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)：提取50 mg肺組織，剪碎并加入1 ml Trizol，用漩渦混勻儀器震蕩混勻，4 ℃、12000 r/min、離心半徑9.5 cm，離心10 min，取上清加入異丙醇(上清液與異丙醇比例為1∶1)震蕩后插入冰中20～30 min，4 ℃、12000 r/min、離心半徑9.5 cm，離心10 min，棄上清加入1 ml 75%乙醇，4 ℃、12000 r/min、離心半徑9.5 cm，離心10 min，棄上清揮發(fā)干凈酒精，加入15～20 μl PCR專用水，震蕩混勻后后采用超微量分光光度儀對(duì)RNA 樣本純度測(cè)定，根據(jù)試劑盒要求將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80 ℃保存，待做熒光定量PCR。引物由南寧天地楊生物科技有限公司設(shè)計(jì)，LTB4上游：5’-TCCCTTTTTCCTACATC-3’，下游：5’-GCTGGCATCCATGCTTC-3’；TNF-α上游：5’-CCTCACCCACACCGT-3’，下游：5’-GCAGGTCCCCCTTAT-3’；IL-8上游：5’-GGAGAAATCAGGGTGGAT-3’，下游：5’-CGACAGAGTAAAGGGCGG-3’；IL-10上游：5’-GACCCACATGCTCCGAGA-3’，下游：5’-TGGCAACCCAAGTAACCC-3’；β-actin上游：5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游：5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。提取循環(huán)結(jié)束后的ΔCt值，采用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)觀察 正常組和自身對(duì)照組大鼠肺組織有少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管壁未見明顯擴(kuò)張?jiān)龊?，支氣管周圍肺組織未見萎縮和纖維化。模型組大鼠肺組織可見支氣管壁擴(kuò)張?jiān)龊?，支氣管周圍肺組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，鄰近肺組織出現(xiàn)纖維化，黏膜下血管擴(kuò)張充血。羅紅霉素組、款冬花散高、中、低劑量組大鼠肺組織病理表現(xiàn)明顯改善，黏膜下血管擴(kuò)張充血減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，支氣管擴(kuò)張周圍肺組織肺纖維化有所改善(圖1)。

A：空白組；B：款冬花散自身對(duì)照組；C：模型組；D：羅紅霉素組；E：款冬花散低劑量組；F：款冬花散中劑量組；G：款冬花散高劑量組圖1 款冬花散對(duì)支氣管擴(kuò)張大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化的影響(HE染色，×20)

2.2 款冬花散對(duì)各組大鼠BALF中LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10含量的影響 與空白組比較，模型組大鼠BALF中LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10的含量均明顯升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，款冬花散低、中、高劑量組大鼠BALF中LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10含量均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與款冬花散低劑量組比較，中劑量干預(yù)組大鼠BALF中LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10的含量均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與款冬花散中劑量組比較，高劑量干預(yù)組大鼠BALF中LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10含量的水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠BALF液LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10含量比較(pg/ml)

2.3 款冬花散對(duì)各組大鼠肺組織LTB4、TNF-α、IL-8、IL-10 mRNA 表達(dá)水平影響 與空白組比較，模型組大鼠肺組織LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10 mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，款冬花散中、高劑量組大鼠肺組織LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10 mRNA表達(dá)均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與款冬花散低劑量組比較，中、高劑量干預(yù)組大鼠肺組織LTB4 mRNA表達(dá)均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，高劑量干預(yù)組TNF-α mRNA、IL-8、IL-10表達(dá)均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與款冬花散中劑量組比較，高劑量干預(yù)組大鼠肺組織LTB4、TNF-α、IL-8及IL-10 mRNA表達(dá)均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 款冬花散對(duì)各組大鼠肺組織LTB4、TNF-α、IL-8、IL-10 mRNA 表達(dá)水平影響

3 討 論

支氣管擴(kuò)張癥的患病率隨年齡增長(zhǎng)而增高，年住院率逐年增加，造成沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，成為全球性公共衛(wèi)生問題。無論在支氣管擴(kuò)張癥急性加重期或穩(wěn)定期，支氣管管腔內(nèi)、管壁和肺組織內(nèi)均存在著炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，持續(xù)性氣道炎癥是支氣管擴(kuò)張癥重要特征之一[9-11]。

中醫(yī)認(rèn)為，肺為嬌臟，喜潤(rùn)惡燥，易聚濕成飲，飲凝成痰，伏于肺金之痰極易化熱或外邪犯肺，郁而化熱，熱傷肺津，煉液成痰，以致痰熱互結(jié)，蘊(yùn)結(jié)于肺，阻礙氣機(jī)，甚則熏灼肺絡(luò)、迫血妄行而引致咯血[12]?！睹麽t(yī)指掌·痰證》中說：“未有有痰而無火，未有有火而無痰者也?！祫?，則泛濫洋溢，以生諸病?！鹫撸禐榕爸\也?！迸R床上支氣管擴(kuò)張癥在急性加重期時(shí)，往往表現(xiàn)出“熱”和“痰”的中醫(yī)癥狀和舌脈象，癥見咳嗽，痰多黏稠，咯吐不爽，口干口渴，身熱，舌紅，苔黃膩，脈滑數(shù)。痰熱蘊(yùn)肺證為支氣管擴(kuò)張癥最常見中醫(yī)證型，治療應(yīng)以清熱化痰為法。

款冬花散源于《婦人大全良方》卷之十三妊娠咳嗽方論第七，組成為款冬花、炙麻黃、浙貝、桑白皮、生石膏、前胡、紫菀、旋覆花、白術(shù)、甘草。款冬花歸肺經(jīng)，能潤(rùn)肺下氣，止咳化痰；炙麻黃味辛，善于宣肺平喘；浙貝藥性苦寒，長(zhǎng)于清熱化痰；桑白皮瀉肺平喘，主治肺熱喘咳；生石膏清熱瀉火，清泄肺熱作用較強(qiáng)；前胡善于降氣祛痰；紫菀化痰止咳；旋覆花消痰降氣；脾為生痰之源，肺為貯痰之器，白術(shù)健脾燥濕；甘草性平味甘，能止咳化痰、調(diào)和藥性。諸藥配伍，全方共奏清熱化痰，平喘止咳之功[13]。

藥理研究表明款冬花含有萜類、黃酮、生物堿等化學(xué)成分，具有抗炎、止咳、祛痰、平喘等藥理活性[14-15]；麻黃堿對(duì)支氣管平滑肌有松弛和解痙作用[16]；浙貝有鎮(zhèn)咳、祛痰、松弛平滑肌作用[17]；桑白皮有抗炎、鎮(zhèn)咳、平喘作用[18-19]；生石膏通過降低下丘腦前列腺素E2含量而起抗炎作用[20]；前胡的揮發(fā)油成分對(duì)大腸桿菌、傷寒沙門菌等有一定的抗菌活性[21-22]；紫菀藥理作用廣泛，有抗菌、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等作用[23]；旋覆花對(duì)銅綠假單胞菌、金葡菌、大腸桿菌等有抗菌活性[24]。

款冬花散原方用于妊娠心膈痰毒壅滯，肺氣不順之咳嗽[13]。但我科結(jié)合此方組成及功效，臨床上用于慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張癥等肺病表現(xiàn)為痰熱郁肺證者相當(dāng)安全、有效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)款冬花散能有效改善慢性阻塞性肺疾病急性加重期痰熱郁肺證患者的肺部證候，提高臨床療效，改善血?dú)夥治黾胺喂δ苤笜?biāo)[25]。本課題組另一項(xiàng)研究亦發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)西醫(yī)治療基礎(chǔ)上加用款冬花散能更明顯的改善支氣管擴(kuò)張癥痰熱壅肺證患者的臨床癥狀，降低血液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、快速C反應(yīng)蛋白、血沉及降鈣素原等炎癥指標(biāo)，具有較好的臨床療效[26]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們以肺組織病理改變，TNF-α、LTB4、IL-8及IL-10含量及mRNA表達(dá)水平作為氣道炎癥程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果表明，款冬花散能減輕支氣管擴(kuò)癥痰熱蘊(yùn)肺證模型大鼠的肺組織炎癥程度，能降低BALF及肺組織的LTB4、TNF-α、IL-8、IL-10含量及mRNA表達(dá)水平，且以高劑量組較為明顯，具有一定的量效關(guān)系趨勢(shì)。

因此，款冬花散能在一定程度上減輕支氣管擴(kuò)張癥痰熱蘊(yùn)肺證模型大鼠氣道炎癥狀態(tài)，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系趨勢(shì)，有望成為支氣管擴(kuò)張癥新的治療藥物，讓更多的患者受益。