利用熒光偏振方法的IDOL/LDLR蛋白相互作用評價體系的建立

李霓，韓江雪，姜新海，許艷妮，司書毅

低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）是細胞表面型受體，在肝臟細胞中呈高表達，它通過胞吞作用將血漿中的 LDL-C轉運至肝臟中進行代謝，從而降低血漿中 LDL-C水平，是治療動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）疾病的重要靶點[1-2]。LDLR 的表達受到轉錄水平及轉錄后水平的調控，其轉錄水平主要受固醇調控元件結合蛋白-2（sterol regulatory element binding protein-2，SREBP-2）的調控[3]；除此之外，LDLR的誘導型降解因子（inducible degrader of the LDL receptor，IDOL）和前蛋白轉化酶枯草溶菌素 9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）能夠通過轉錄后水平對 LDLR 的表達進行調控[4-5]。

IDOL 是一個依賴于固醇調節(jié)的 E3 泛素連接酶，能夠介導 LDLR 泛素化進而經(jīng)溶酶體途徑降解，主要受到肝 X 受體（liver X receptor，LXR）的調控，這與 PCSK9 對 LDLR 的降解機制有所不同[4,6]。IDOL 包含兩個主要功能結構域，即 N端的 FERM 區(qū)和 C 端的 RING 區(qū)[7]。FERM 區(qū)負責與 LDLR 胞內部分相結合，RING 區(qū)與泛素結合酶 E2D（ubiquitin conjugating enzyme E2D，UBE2D）結合，隨后 LDLR 被 UBE2D 泛素化修飾，最終導致 LDLR 在溶酶體降解[8]。研究表明，抑制 IDOL 對 LDLR 的降解將有效提高肝臟LDLR 表達，有利于減少血漿中 LDL-C 水平[9]。因此，抑制 IDOL/LDLR 蛋白相互作用是抗 AS 藥物研發(fā)的新思路。有學者對 IDOL 與 LDLR 的相互作用以及降解機制進行了透徹的研究，并通過同源模建、染色質免疫共沉淀等手段確證了兩個蛋白的結合界面[10]。熒光偏振（fluorescence polarization，F(xiàn)P）技術具有簡便、高效、重復性好的優(yōu)勢，是體外水平研究蛋白質相互作用的重要方法[11]。

本實驗通過原核表達并純化獲得人全長 IDOL重組蛋白，將能夠與 IDOL-FERM 區(qū)相結合的LDLR 多肽片段進行異硫氰酸熒光素（fluorescence isothiocyanate，F(xiàn)ITC）熒光標記，利用熒光偏振方法，建立體外 IDOL/LDLR 的蛋白相互作用體系，確定 IDOL 與 LDLR 作用區(qū)域，探索最適條件，為基于 IDOL/LDLR 相互作用的抗 AS 小分子抑制劑的開發(fā)和評價提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌株 pET-30a(+) 原核表達質粒購自美國 Novagen 公司；pCMV3-IDOL 商品化質粒購自義翹神州公司；大腸桿菌E. coliDH5α 克隆感受態(tài)細胞和E. coliTransetta(DE3) 表達感受態(tài)細胞購自北京全式金公司。

1.1.2 試劑 DNA marker、膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒均購自北京全式金公司；DNA 連接酶購自美國 Promega 公司；限制性內切酶購自日本Takara 公司；DNA 聚合酶 2 × Es Taq MasterMix購自康為世紀公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自美國 ThermoFisher 公司；胰蛋白胨、酵母提取物和瓊脂粉均購自英國 Oxoid 公司；硫酸卡那霉素和異丙基 β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自美國Amresco 公司；HisTrap 層析柱購自美國 GE 公司；384 孔不透明黑色檢測板購自美國 Corning 公司；其他生化試劑為國產分析純。

1.1.3 主要儀器 AKTA explorer 型蛋白層析系統(tǒng)為美國 GE Health 公司產品；3-18K 型高速冷凍離心機為美國 Sigma 公司產品；TS 型高壓細胞破碎儀為北京康坦科技有限公司產品；EnVision 2104型酶標儀為美國 PerkinElmer 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成 在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中查得IDOL（NM_013262.3）基因全長為 1338 bp，共編碼 445 個氨基酸，蛋白分子量約為 50 kD。根據(jù)其編碼序列設計引物，上游：5' CGGGATCCATGC TGTGTTATGTGACGA 3'（下劃線部分為BamH I酶切位點）；下游：5' CCGCTCGAGTTAGATTACA GTCAGATTGAGAA 3'（下劃線部分為XhoI 酶切位點）。擴增全長片段，引物由睿博興科有限公司合成。

1.2.2 pET-30a-IDOL 原核表達質粒的構建 pCMV3-IDOL 質粒含有 IDOL ORF，因此，以該質粒為模板，進行 PCR 擴增人全長 IDOL 基因。反應條件為：94 ℃ 預變性 5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，共 35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。PCR 產物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

將 IDOL 的 PCR 產物及質粒 pET-30a(+) 分別進行BamH I 和XhoI 雙酶切反應，經(jīng) T4 DNA連接酶 4 ℃ 連接 12 h，之后轉化至大腸桿菌E.coliDH5α 感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落 PCR 及雙酶切鑒定后，送測序。經(jīng)鑒定序列正確，重組表達質粒命名為 pET-30a-IDOL。

1.2.3 His-IDOL 蛋白的原核表達及純化 將pET-30a-IDOL 重組質粒轉化至E.coliTransetta(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)卡那霉素抗性篩選后，挑取單克隆于 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待OD600達 0.6 時，加入終濃度為 0.5 mmol/L 的 IPTG，分別于 15 ℃ 和37 ℃ 條件下，100 r/min 過夜誘導重組蛋白表達。之后離心并收集菌體，超聲破碎后，利用SDS-PAGE 電泳分別檢測兩種誘導條件對重組蛋白全菌以及上清表達水平的影響。

將 600 ml 過夜誘導的菌體離心，用上樣緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 7.4）重懸菌體，采用高壓細胞破碎儀裂解菌體，4 ℃ 高速離心后將上清液用 0.45 mm 濾膜過濾。由于表達的重組 IDOL 蛋白帶有 His 標簽，因此采用Ni2+螯合的 HisTrap HP 親和層析柱進行層析，用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 7.4）進行梯度洗脫，收集對應洗脫峰蛋白并利用 BCA 試劑盒定量以及 SDS-PAGE 電泳鑒定。

1.2.4 多肽的設計與合成 根據(jù)文獻[10]報道，LDLR 的 811 ～ 833 位氨基酸可與 IDOL 蛋白相互作用，因此，我們以 FITC 標記該氨基酸片段，便于后續(xù)熒光偏振測定。FITC 標記的 LDLR 多肽熒光探針（FITC-LDLR：FITC-CKNWRLKNINSINF DNPVYQKTTE）由上海強耀生物公司合成，并用DMSO 溶解為 2 mmol/L 溶液，于 -20 ℃ 保存。

1.2.5 FITC-LDLR 多肽最佳反應濃度的確定 將2 mmol/L FITC-LDLR 以 FP 反應緩沖液（PBS，0.01% Triton X-100，0.1 mg/ml BSA，pH 7.4）進行倍比稀釋，至終濃度分別為 1000、500、250、125、62.5、31.25、15、7.5、3.75、1.875 nmol/L，依次加入到 384 孔板中，每孔 20 μl，設置 3 個重復孔，于 25 ℃ 避光 100 r/min 振蕩孵育 30 min，以多功能酶標儀檢測 ΔmP 值，摸索最適多肽濃度。

1.2.6 His-IDOL 與 FITC-LDLR 結合實驗和穩(wěn)定性測定 將純化后的 His-IDOL（30 μmol/L）蛋白以 FP 反應緩沖液進行 2 倍稀釋，依次加入至384 孔板中，每孔 10 μl，使得蛋白終濃度分別為15 000、7500、3750、1875、960、480、240、120、60、30、15 nmol/L，之后加入 2 μl FITC-LDLR（終濃度 500 nmol/L），8 μl FP 反應緩沖液，總反應體系為 20 μl。設置 3 個重復孔，于 25 ℃ 避光100 r/min 振蕩孵育 30 min，以多功能酶標儀檢測ΔmP 值。將上述反應分別于 30 min、1 h、2 h 反應，摸索最佳反應時間。以 GraphPad Prism5.0 軟件擬合結合曲線，計算 His-IDOL 與 FITC-LDLR結合反應的解離平衡常數(shù)（Kd）以及蛋白的半數(shù)有效濃度（EC50）。

2 結果

2.1 重組表達質粒 pET-30a-IDOL 的構建

以 pCMV3-IDOL 質粒為模板，對人 IDOL 全長基因片段進行 PCR 擴增，電泳結果顯示，800 ～1500 bp 之間有一條特異性明亮條帶，目的基因大小相符（圖1A）。將經(jīng)過BamH I 和XhoI 雙酶切的 IDOL PCR 產物與 pET-30a(+) 空載體連接，轉化至E.coliDH5α 感受態(tài)細胞，挑取單克隆進行菌落 PCR 鑒定。結果顯示，菌株 1 ～ 4 號均擴增出與目的基因大小相符的條帶（圖1B）。之后從中挑取菌株 1 保菌并提取質粒，重組質粒經(jīng)BamH I和XhoI 雙酶切后，顯示約 1344 bp 大小的條帶，與目的基因大小一致（圖1C）。同時，將該陽性克隆測序，結果與目標基因序列完全一致。上述結果表明，我們成功構建了 pET-30a-IDOL 原核表達質粒。

圖1 重組表達質粒 pET-30a-IDOL 的構建[A：IDOL 基因的 PCR 擴增（M：DNA 分子量標準；1 ～ 3：IDOL 基因的 PCR產物）；B：菌落 PCR 鑒定（M：DNA 分子量標準；1 ～ 4：pET-30a-IDOL 菌落 PCR 產物）；C：重組質粒 pET-30a-IDOL的雙酶切鑒定（M：DNA 分子量標準；1：經(jīng)酶切的重組質粒 pET-30a-IDOL；2：未經(jīng)酶切的重組質粒 pET-30a-IDOL）]Figure 1 The construction of pET-30a-IDOL recombinant plasmid [A: PCR amplification of IDOL gene (M: DNA marker;1 - 3: PCR product of IDOL); B: PCR of IDOL in E.coli DH5α (M: DNA marker; 1 - 4: PCR product of pET-30a-IDOL in E.coli DH5α); C: Digestion identification of pET-30a-IDOL recombinant plasmid (M: DNA marker; 1: Digestion product of pET-30a-IDOL;2: pET-30a-IDOL recombinant plasmid)]

2.2 His-IDOL 重組蛋白的表達與純化

將 pET-30a-IDOL 重組質粒轉化至E.coliTransetta(DE3) 感受態(tài)細胞，經(jīng) IPTG 誘導表達。結果表明，與轉化有空載體 pET-30a(+) 的菌株相比，15 ℃ 和 37 ℃ 條件下均表達出與目的蛋白大小一致的蛋白（約 55 kD）（圖2），說明蛋白表達成功。由于低溫條件蛋白更易可溶性表達，因此，后續(xù)我們采用 0.5 mmol/L 的 IPTG、15 ℃、100 r/min 過夜條件，誘導重組蛋白表達。經(jīng)HisTrap 層析柱分離純化后，收集不同咪唑濃度下洗脫的蛋白，并進行 SDS-PAGE 電泳分析。結果表明，200 mmol/L 及 300 mmol/L 咪唑濃度洗脫均能夠獲得較高純度的 His-IDOL 重組蛋白（圖3）。將 300 mmol/L 咪唑濃度洗脫蛋白（＞ 90% 純度）富集，進行超濾濃縮，用于后續(xù)熒光偏振實驗測定。

圖2 His-IDOL 的原核表達Figure 2 The expression of His-IDOL

圖3 His-IDOL 的蛋白純化原核表達Figure 3 The purification of His-IDOL

2.3 FITC-LDLR 最佳反應濃度確定

實驗結果表明，從 1000 nmol/L 開始，隨著多肽濃度的降低，F(xiàn)ITC-LDLR在實驗體系中的 ΔmP值表現(xiàn)出顯著升高的趨勢（圖4）。在熒光偏振體系中，僅有多肽存在時，ΔmP 值處于 25 ～ 50 之間為最佳，這與待測熒光標記分子的分子量大小及構象有直接關系。為了保持本實驗體系具有較好的靈敏度及較低的本底值，選用 500 nmol/L FITC-LDLR 用于后續(xù)結合反應。

圖4 最佳多肽濃度的確定Figure 4 Determination of the optimal concentration of peptides in FP assay

2.4 熒光反應體系的確定

采用飽和曲線法，首先測定 His-IDOL 與FITC-LDLR 結合能力。熒光偏振實驗結果表明，His-IDOL 與 FITC-LDLR 能夠很好地結合，并且在 10 μmol/L 濃度下達到飽和，最大 ΔmP 值為183，該反應Kd值為 1.64 μmol/L（圖5A）。實驗結果表明，隨著 His-IDOL 蛋白濃度的增加，蛋白的 EC50值逐漸升高，當 His-IDOL 約為 2 μmol/L時，ΔmP 值穩(wěn)定在 140 左右，此時具有較高靈敏度和較大信號窗（圖5B）。隨后，確定不同孵育時間對該反應穩(wěn)定性的影響。結果表明，分別孵育 30 min、1 h 和 2 h 后，結合反應的Kd值和ΔmP 值保持穩(wěn)定，對應Kd值分別為 1.59、1.54和 1.63 μmol/L（圖5C）。本實驗選擇 500 nmol/L FITC-LDLR 和 2 μmol/L His-IDOL 于 25 ℃、100 r/min 振蕩避光孵育 1 h 作為最優(yōu)反應體系。該體系的成功構建為研究 IDOL/LDLR 蛋白相互作用提供了新的方法。

圖5 IDOL/LDLR 相互作用的熒光偏振測定及優(yōu)化最佳多肽濃度的確定（A：飽和曲線測定；B：量效曲線測定；C：作用時間優(yōu)化）Figure 5 FP assay of IDOL/LDLR interaction and optimization (A: Saturation binding curves; B: Concentration-response curve;C: Optimization of reaction time)

3 討論

提升肝臟中 LDLR 表達水平對于預防高脂血癥具有重要意義，也是治療 AS 疾病的核心藥物靶點。目前臨床廣泛應用的他汀類藥物就是通過SREBP2 轉錄因子增加 LDLR 表達水平從而降低血漿 LDL-C 水平的。但他汀類藥物副作用及局限性不容忽視[12-13]。除了受到轉錄水平調控之外，LDLR 轉錄后水平的調控對于其蛋白水平同樣重要。IDOL（也稱為 MYLIP），是能夠與 LDLR 結合的 E3 泛素連接酶，通過泛素化降解來調節(jié)LDLR 的表達水平。Zelcer 等[4]發(fā)現(xiàn)，IDOL 是LXR 的重要靶基因，不同細胞和組織中，LXR 的激動劑，如 GW3965 和 T0901317 能夠上調IDOL 表達水平，從而抑制 LDLR 的表達。SREBP以及 LXR 是兩個重要的轉錄因子家族，共同維持著機體膽固醇水平的平衡，包括內源性膽固醇的合成、多余膽固醇的外流和轉化等途徑[14-15]。LXR-IDOL-LDLR 軸平衡對于機體膽固醇穩(wěn)態(tài)十分重要，并且其對 LDLR 的內化和途徑溶酶體的降解過程不依賴于網(wǎng)格蛋白和小泡，這與 PCSK9對 LDLR 的調控機制截然不同[16-17]。

抑制 IDOL 對 LDLR 的降解，有利于提升肝臟 LDLR 表達水平，有望成為抗 AS 藥物開發(fā)的新思路。2015年，Zhou 等[18]發(fā)現(xiàn) DHA 通過多重機制增加肝臟中 LDLR 的表達水平，其中包括通過 LXR-IDOL 軸調控。另外，Nelson 等[19]利用抑制 IDOL 活性的手段，提高了 LDLR 肝臟中表達水平。由此可見，無論是下調 IDOL 表達或者抑制其泛素連接酶活性，均能夠有效增加 LDLR 表達。以蛋白-蛋白相互作用為靶點的研究從功能角度更加接近細胞生理狀態(tài)，相對于以單個蛋白為靶點的體外篩選模型具有更好的選擇性和特異性，不易造成“脫靶”現(xiàn)象。熒光偏振是研究蛋白質與小分子、多肽相互作用的重要方法，目前基于此方法建立的小分子抑制劑篩選模型以及評價體系在藥物研發(fā)領域得到了廣泛的使用[20]。因此，本研究基于熒光偏振方法建立體外 IDOL/LDLR 蛋白相互作用體系，具有操作簡便、穩(wěn)定性好、重復度高等優(yōu)勢。

在不同國家和地區(qū)的 GWAS 調查中顯示，IDOL 蛋白表達水平與人類血脂譜以及單核苷酸多態(tài)性具有密切相關性[21]。比如，2019年調查顯示，IDOL 蛋白的 G51S 突變體對于 LDLR 有更強的親和力以及降解活性，因此 G51S 突變體人群中LDL-C 明顯高于普通樣本值[22]；2020年在新疆維吾爾自治區(qū)流行病學統(tǒng)計顯示，漢族人群中 IDOL基因 rs9370867 與高血脂癥相關[23]。這些都說明IDOL 蛋白對于高膽固醇血癥的調控具有重要的生理意義。隨著對 IDOL 蛋白研究的逐步深入，IDOL的相關動物模型以及與之有相互作用網(wǎng)絡的蛋白相繼出現(xiàn)。2016年，Ibrahim 等[24]利用腺病毒載體構建了肝臟組織中特異表達 IDOL 蛋白的人源化小鼠模型，并發(fā)現(xiàn)該模型小鼠的血漿膽固醇水平顯著升高，由此，從整體動物水平對 IDOL 生理功能的研究也得到不斷豐富。因此，進一步探索 IDOL蛋白的作用機制，圍繞 IDOL 蛋白開展多元化靶點的研究，構建合理有效的藥物篩選模型，對抗 AS藥物研發(fā)具有深遠的意義。

綜上所述，本研究通過原核表達并純化獲得人全長 IDOL 蛋白，利用熒光偏振方法，建立體外IDOL/LDLR 的蛋白相互作用體系，確定 IDOL 與LDLR 作用方式以及最適反應條件，為今后基于IDOL/LDLR 相互作用的小分子抑制劑的開發(fā)和AS 疾病的治療提供了新的策略。