蜂毒肽的抗炎作用及其不良反應(yīng)

李修政，蔣劍敏，錢佳瑜，許曉東，董家瀟，嚴佳棟

炎癥是機體對外來刺激的一種自我防御反應(yīng)，其起因包括外傷、感染以及影響體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的污染物等，通常情況下是對人體有益的，但慢性炎癥會導(dǎo)致風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、炎性腸病、哮喘和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等相關(guān)疾病[1]。蜂毒肽（Mel）是蜂毒的主要成分，占其干重的 40% ～ 60%，由 26 個氨基酸殘基組成（NH2GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-CONH2），分子式為C131H228N38O32，其中極性和非極性氨基酸殘基分布不均勻，在折疊成 α-螺旋構(gòu)型時產(chǎn)生蜂毒肽的兩親結(jié)構(gòu)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，高劑量蜂毒肽會引起瘙癢、發(fā)炎和局部疼痛等癥狀，而小劑量時則具有廣泛的抗炎作用[3]。本文主要介紹蜂毒肽在抗炎中的應(yīng)用以及存在的不良反應(yīng)和目前的解決辦法，以期為后續(xù)的研究提供理論依據(jù)和科學(xué)基礎(chǔ)。

1 蜂毒肽的抗炎作用

1.1 抗關(guān)節(jié)炎作用

關(guān)節(jié)炎是影響關(guān)節(jié)和周圍組織的慢性炎癥疾病，目前發(fā)病機制尚不明確，現(xiàn)有的治療方案雖然效果明顯，但長期使用會產(chǎn)生嚴重的副作用。在哺乳動物中，NF-κB 家族由五名成員組成：Rel-A（p65）、Rel-B、c-Rel、NF-κB1（p50 及其前體 p105）和 NF-κB2（p52 及其前體 p100），它們形成多種同源二聚體和異二聚體，其中最普遍的活化形式是異二聚體 p65-p50[4]。Park 等[5]證明 Mel 可以直接與蛋白p50 結(jié)合，抑制 LPS 誘導(dǎo)的 p50 易位到核內(nèi)，使炎癥基因轉(zhuǎn)錄減少，最終導(dǎo)致 NF-κB 靶點失活。在后續(xù)的研究中，他們發(fā)現(xiàn)在小鼠巨噬細胞系和滑膜細胞中，Mel 與 IKK 信號通路相互作用可抑制 TNF-α/LPS 誘導(dǎo)的 NO 和 PGE2的產(chǎn)生[6]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）可引起關(guān)節(jié)軟骨和關(guān)節(jié)囊的破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)強直畸形，而成纖維樣滑膜細胞（FLS）的凋亡和自噬是 RA 病理生理學(xué)中的重要組成部分。He等[7]通過一系列的實驗數(shù)據(jù)表明，Mel 能顯著降低 RA-FLS的存活率，促進細胞凋亡和自噬，抑制 IL-1β 的分泌。該小組在先前的實驗中就已證明 Mel 能調(diào)節(jié)膠原誘導(dǎo) SD大鼠模型 Th17/Treg 的平衡，從而抑制關(guān)節(jié)的炎癥[8]。18 只建模成功的大鼠，分為模型組、蜂毒肽組、甲氨蝶呤組，第14 天分別注射滅菌水、蜂毒肽（0.5 mg/kg）和甲氨蝶呤（1 mg/只），32 天后麻醉處死，觀察血清中 TNF-α、IL-10、IL-17 A 濃度變化。結(jié)果顯示，Mel、甲氨蝶呤均可抑制炎癥因子產(chǎn)生，延緩骨骼破壞。

1.2 抗動脈粥樣硬化作用

動脈粥樣硬化（AS）是一種由脂質(zhì)、單核細胞和動脈壁細胞之間的相互作用引起的慢性動脈炎性疾病，血管平滑肌細胞（VSMC）的增殖和凋亡在 AS 病變的進展中起重要作用，并且認為 NF-κB 信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)在細胞凋亡和增殖中起關(guān)鍵作用，是治療 AS 的潛在靶點[9-10]。Son 等[11-12]研究了 NF-κB 信號通路作為培養(yǎng)大鼠主動脈 VSMC 細胞凋亡的有效機制，發(fā)現(xiàn) Mel 不僅抑制血小板衍生生長因子受體（PDGFR）β-酪氨酸磷酸化，還抑制大鼠主動脈VSMC 中下游的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并阻斷 PDGFR 信號傳導(dǎo)中的 AKT 磷酸化。此外，Mel 可以誘導(dǎo)促凋亡蛋白 p53、Bax 和 caspase-3 等的表達，但會降低抗凋亡蛋白 Bcl-2的表達。體內(nèi)實驗表明，Mel 通過降低 AS 小鼠中 TNF-α、IL-1β、VCAM-1、ICAM-1 和 TGFβ-1 的表達，達到降低總膽固醇和甘油三酯水平的目的。Cho 等[13]通過 Mel 處理TNF-α 刺激的人 VSMC，用質(zhì)譜和凝膠電泳來檢測蛋白質(zhì)的表達差異，鑒定了 33 種在 Mel 處理后具有不同表達模式的蛋白質(zhì)，包括抗凋亡蛋白（如 stress-70 蛋白）和膜聯(lián)蛋白 A1，并鑒定出幾種炎癥和增殖的靶標，如抑制素、膜聯(lián)蛋白 1 和鈣網(wǎng)蛋白等。進一步通過細胞內(nèi)信號通路分析，表明 EGFR 和 NF-κB 是 TNF-α 處理的人 VSMC炎癥的主要信號分子，有助于闡明 Mel 的抗動脈粥樣硬化機制。

1.3 抗皮炎作用

痤瘡丙酸桿菌是皮膚痤瘡發(fā)生的主要原因，其致病機制是激活 Toll 樣受體 2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使角質(zhì)形成細胞和單核細胞，從而分泌促炎性因子，包括 TNF-α、IL-1β 和 IL-8[14]。Lee 等[15]研究了蜂毒肽對熱滅活的痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的HaCaT 細胞反應(yīng)，在滅活痤瘡丙酸桿菌處理的 HaCaT 細胞中加入 Mel，減弱了 IKK、IκB、NF-κB 的產(chǎn)生并增加p38 磷酸化，這表明 Mel 可以阻斷 HaCaT 細胞中 NF-κB和 p38 MAPK 信號傳導(dǎo)來消除痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的炎癥細胞因子的產(chǎn)生。在動物模型中驗證了這一機制，經(jīng)痤瘡丙酸桿菌處理的小鼠耳朵在注射 Mel 時，腫脹和肉芽腫反應(yīng)明顯減少。該小組在另一項研究中表明，Mel 對熱殺死的痤瘡丙酸桿菌誘導(dǎo)的人 THP-1 單核細胞炎癥中具有抑制作用[16]。除對痤瘡性皮炎有顯著作用外，Mel 對特應(yīng)性皮炎也有治療作用。特應(yīng)性皮炎俗稱特應(yīng)性濕疹，表現(xiàn)為瘙癢、皮膚干燥、免疫反應(yīng)異常以及免疫球蛋白 IgE 介導(dǎo)的對各種外源抗原的過敏。An 等[17]從特應(yīng)性皮炎模型中證實，Mel 對 1-氯-2,4-二硝基苯（DNCB）誘導(dǎo)的體內(nèi)和腫瘤壞死因子（TNF）-α/IFN-γ 誘導(dǎo)的體外均存在藥理作用，Mel 具有強大的抗異位活性，使 DNCB 誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎樣皮膚損傷減少。在使用 TNF-α/IFN-γ 刺激的人角質(zhì)形成細胞的體外研究表明，Mel 通過阻斷 NF-κB 和 STAT 信號通路，從而抑制趨化因子（TARC/CCL17、MDC/CCL22）和促炎性細胞因子（IL-1β、IL-6、IFN-γ 等）的表達。Kim 等[18]發(fā)現(xiàn) Mel 對小鼠卵清蛋白引起的特應(yīng)性皮炎具有治療作用，即將 Mel 用來處理卵清蛋白（OVA）貼片誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎，發(fā)現(xiàn)小鼠皮膚增厚和炎性浸潤明顯減輕。此外，Mel 還可以通過阻斷 STAT3 的激活，從而抑制 IL-4/IL-13誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細胞微絲蛋白表達下調(diào)。

1.4 神經(jīng)退行性疾病的應(yīng)用

神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元或其髓鞘的喪失所致，隨著時間的推移而惡化，以導(dǎo)致功能障礙，包括帕金森病（PD）、阿爾茨海默病（AD）以及肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS）等[19-20]。體外研究表明，Mel 對 H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)母細胞瘤 SH-SY5Y 的細胞凋亡具有神經(jīng)保護作用，經(jīng) H2O2處理的細胞活力降低，caspase-3 的產(chǎn)量增加，而 Mel 的參與增加了細胞活力并減少了凋亡細胞的 DNA 片段化，減弱H2O2誘導(dǎo)的抗凋亡因子 Bcl-2 的表達[21]。Mel 還通過阻斷LPS 誘導(dǎo)的 BV2 小膠質(zhì)細胞系中 NF-κB 的活化而抑制NO 和 iNOS 的表達，表明 Mel 對 BV2 小膠質(zhì)細胞的促炎癥反應(yīng)有抑制作用，可以作為治療伴小膠質(zhì)細胞激活的神經(jīng)退行性疾?。ɡ?PD）的潛在藥物[22]。Yang 等[23]研究了 Mel 在小膠質(zhì)轉(zhuǎn)基因小鼠模型中對 ALS 的治療效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng) Mel 治療的動物可以激活腦干和脊髓中的小膠質(zhì)數(shù)量，降低促炎癥因子 TNF-α 的表達，從而抑制脊髓中神經(jīng)元減少，改善運動功能。盡管 ALS 的主要問題是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，但 ALS 還影響其他器官，包括肝臟、脾臟和肺，Mel 治療可減輕 ALS 動物模型中的炎癥并刺激脾臟和肺細胞存活的信號傳導(dǎo)[24]。此外，Mel 通過激活分子伴侶和減輕 α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)錄后的修飾來調(diào)節(jié)錯誤折疊蛋白的產(chǎn)生，這也是 PD 和 ALS 病癥的一個重要機制[25]。除以上作用外，Mel 在處理 ALS 引起的其他器官的問題也具有顯著的效果，在減輕炎癥的同時刺激 ALS 動物模型中脾臟和肺細胞存活的信號傳導(dǎo)，并抑制有癥狀 ALS 轉(zhuǎn)基因小鼠肺中 CD14 和炎癥蛋白 Iba-1 的表達。

1.5 其他

Mel 作為一種天然肽具有多種藥理活性，目前已知在肝炎、結(jié)腸炎等方面也具有潛在藥用價值。Park 等[26]發(fā)現(xiàn)Mel 可減輕肝損傷、炎癥和肝纖維化，抑制 TNF-α 處理的肝星狀細胞（HSC）中的 TNF-α 分泌以及 IL-1β 和 IL-6的表達。在 TNF-α 處理的肝細胞中，Mel 抑制 NF-κB 的DNA 結(jié)合以及 NF-κB 的啟動子活性，表明 Mel 通過抑制NF-κB 活化來抑制肝細胞凋亡。該組還證明了 Mel 可以阻斷 D-半乳糖胺和 LPS 誘導(dǎo)的小鼠肝衰竭模型中的 NF-κB信號傳導(dǎo)和凋亡途徑，從而來抑制肝衰竭[27]，降低高致死率，減輕肝病理損傷和肝功能炎癥反應(yīng)并抑制肝細胞的凋亡。Ahmedy 等[28]發(fā)現(xiàn) Mel 可以減輕 TLR4/TRAF6 介導(dǎo)的 NF-κB 和 p38MAPK 信號通路，在醋酸誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎中起抗?jié)冏饔谩Ｒ缘蛣┝浚?0 mg/kg）作為對照，Mel 組表現(xiàn)出明顯改善醋酸引起的組織學(xué)損傷作用，有效抑制 TNF-α 和 IL-6 含量升高，并且減弱醋酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。Mel 對完全弗氏佐劑誘導(dǎo)（CFA）的慢性前列腺炎大鼠模型也具有顯著作用，前列腺內(nèi)注射 CFA 可引起局部痛覺敏感，持續(xù)時間至少 2 周以上。前列腺中 COX-2和脊髓中 GFAP 的表達也升高。Mel 治療可顯著提高痛閾，減少炎癥浸潤，抑制 COX-2 和 GFAP 的表達[29]。除上述藥理作用外，Mel 還可以激活 HDAC2 介導(dǎo)的GSK-3b/Nrf2/ARE 信號通路，改善 CVB3 誘導(dǎo)的心肌炎，但由于副作用明顯，用于臨床還需要進一步探討[30]。

2 不良反應(yīng)及應(yīng)對策略

Mel 是蜂毒的主要成分，被稱為致敏肽，其安全性仍是限制臨床應(yīng)用的主要因素。在一項 Meta 分析中對 145 項研究進行分析，有 58 項研究發(fā)生了不良事件[31]。Mel 的應(yīng)用可能會引起免疫系統(tǒng)反應(yīng)、局部反應(yīng)、超敏反應(yīng)、皮膚問題和非特異性反應(yīng)等，給藥頻率和劑量是目前導(dǎo)致嚴重不良反應(yīng)的直接原因，具體機制需要進一步研究[32-33]。

2.1 溶血、細胞毒反應(yīng)

早在 1972年，就已確認 Mel 具有溶血活性[34]。Mel的天然靶標是含有大量膽固醇（45%）的紅細胞膜，在亞微摩爾濃度下，以劑量和時間依賴性方式對人外周血淋巴細胞（HPBL）具有細胞毒性，當 Mel 引起溶血時，增加了離子的滲透性，當陽離子從細胞膜排出后，紅細胞出現(xiàn)腫脹并釋放血紅蛋白[35-36]。Raghuraman 和 Chattopadhyay[37]在膽固醇對 Mel 的溶血活性研究中發(fā)現(xiàn)，使用甲基-β-環(huán)糊精（MβCD）對大鼠紅細胞中的膽固醇進行特異性消耗，當膽固醇減少 55% 時，Mel 的溶血作用增強了約 3 倍，并且沒有任何明顯的磷脂損失，表明膽固醇與 Mel 溶血能力強弱密切相關(guān)。

2.2 超敏反應(yīng)

蜂毒組成復(fù)雜，包括蜂毒素、谷氨酰胺、肥大細胞脫粒肽、組胺、阿托拉品、寡肽、磷脂、糖、磷酸脂酶 A2、透明質(zhì)酸酶、酸性磷酸酯酶等。20世紀70年代，Paull等[38]發(fā)現(xiàn)蜂毒肽可在約三分之一患者當中誘導(dǎo) IgE 反應(yīng)，推測是蜂毒肽純度不高所致。純化的蜂毒肽可能含有強過敏原的殘基，目前市售蜂毒肽常含有透明質(zhì)酸酶、磷酸脂酶 A2 和酸性磷酸酯酶等。近年來主要通過放射性過敏原吸附試驗（RAST）檢測特異性 IgE 抗體，已證實蜂毒肽是高度純化制劑中的過敏原，致敏率為 22.9% ～ 29%[39]。

2.3 遺傳毒性

Gajski 等[35]發(fā)現(xiàn)蜂毒肽以劑量和時間依賴性方式對人外周血淋巴細胞（HPBLs）具有細胞毒性，并誘導(dǎo)細胞形態(tài)改變，肉芽形成和裂解。在使用非細胞毒性濃度的蜂毒肽處理 HPBLs 后，DNA 損傷加劇，除此之外，Mel 還參與調(diào)節(jié)細胞凋亡（Bax、Bcl-2、Cas-3、Cas-7）、DNA 損傷相關(guān)的基因表達（TP53、CDKN1A、GADD45α、MDM）和氧化應(yīng)激（CAT、GCLC、GPX1、GSR、SOD1）等。研究表明，遺傳毒性與谷胱甘肽水平的降低、活性氧物質(zhì)的形成增加、磷脂酶 C 活性和脂質(zhì)過氧化作用增加一致，顯示出氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)作用[40]。

2.4 應(yīng)對策略

蜂毒肽在抗炎方面的廣泛用途越來越引起科研人員的關(guān)注，但其明確的毒副作用限制了臨床的進一步應(yīng)用。針對此類肽的缺點，目前研究人員致力于從結(jié)構(gòu)修飾、載體遞送和融合蛋白等方面來減少毒性，增加療效。Wu 等[41]受到全碳氫交聯(lián)訂書肽啟發(fā)，將該系統(tǒng)用于蜂毒肽中，得到一系列蜂毒肽衍生物，與蜂毒肽相比，該類衍生物可明顯降低蜂毒肽的溶血活性并增加細胞穿透性，達到合理的蛋白酶穩(wěn)定水平。Gui 等[42]開發(fā)了一種聚電解質(zhì)的納米復(fù)合系統(tǒng)，其中帶正電的門控調(diào)節(jié)毒素（GMT）和帶負電的葡聚糖硫酸鹽（DS）之間形成強相互作用，該系統(tǒng)可以延長蜂毒肽釋放，降低急性毒性和增加給藥效率。李亞巍[43]構(gòu)建的 Mel@ZIF納米載藥體系在高出 Mel 單體十幾倍濃度的時候僅具有8% 的溶血活性，并且能減少對正常組織細胞的非特異性細胞毒性。除以上方法外，通過蛋白融合途徑也表現(xiàn)出較滿意的結(jié)果。Rayahin 等[44]發(fā)現(xiàn) Mel 和谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶融合可以使其毒性降低，并且在超過天然蜂毒濃度下仍保留抗炎特性，這種方法可作為蜂毒肽的無毒替代品。

3 展望

經(jīng)過數(shù)十年的努力，國內(nèi)外研究人員發(fā)現(xiàn) Mel 在多領(lǐng)域具有確切的生物學(xué)作用，包括抗炎、抗癌、抗菌和抗病毒等。本文總結(jié)了 Mel 在抗炎方面的應(yīng)用以及易發(fā)生的不良反應(yīng)和部分解決方案，但對于 Mel的具體作用機制和不良反應(yīng)尚不能提供滿意的解決方案，需要進一步研究。目前Mel 在炎性疾病的臨床應(yīng)用還需要新的研究策略，包括發(fā)展新的遞送系統(tǒng)、結(jié)構(gòu)修飾和多方式聯(lián)合給藥等。我國具有豐富的蜂毒資源和眾多炎性疾病患者，Mel 的研究具有廣闊的前景和開發(fā)價值，期待高效低毒的 Mel 藥物盡快投入臨床。