非編碼RNA在膽管癌相關(guān)信號(hào)通路中的研究進(jìn)展

毛俊，瞿巧莉，曾珍，仁趙玲，胡瑩

膽管上皮癌（cholangiocarcinoma，CCA）屬于罕見的惡性腫瘤，主要由膽管上皮細(xì)胞癌變而來，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，惡性腫瘤中 CCA 僅占 2%，發(fā)病率卻在逐漸升高[1]。據(jù)調(diào)查研究，在 2000 - 2015年期間，CCA 在美國的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢[2]。不僅如此，其發(fā)病率在其他地區(qū)大多數(shù)國家同樣有所增加[3]。CCA 根據(jù)病變解剖位置，分成肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICCA）和肝外膽管癌（extrahepatic cholangiocarcinoma，ECCA）[1,4]。目前，診斷 CCA 通常采取實(shí)驗(yàn)室檢查，影像學(xué)檢查和組織活檢等[5]，缺乏早期特異性標(biāo)志物。故通常在晚期發(fā)現(xiàn)，即使行手術(shù)切除，預(yù)后也不樂觀。

非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指不編碼蛋白質(zhì)，但能從基因轉(zhuǎn)錄組上轉(zhuǎn)錄而來的 RNA。包括微小RNA（micro RNA，miRNA）和長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）等。有研究表明，ncRNA 可以充當(dāng)癌癥的致癌驅(qū)動(dòng)因子或腫瘤抑制因子，通過多種信號(hào)通路參與腫瘤的進(jìn)展或抑制[6]。本文將重點(diǎn)介紹 ncRNA 通過某些信號(hào)通路促進(jìn)或抑制 CCA 進(jìn)程的研究進(jìn)展。

1 ncRNA 與 CCA 相關(guān)信號(hào)通路

1.1 Hedgehog 信號(hào)通路

Hedgehog（hh）信號(hào)通路與腫瘤生成息息相關(guān)，其中Sonic hedgehog（Shh）是 hh 蛋白中研究最為廣泛的，其激活主要通過典型信號(hào)傳導(dǎo)（依賴 GLI）和非典型信號(hào)傳導(dǎo)（不依賴 GLI）[7]。早期研究就已經(jīng)證明 Shh 信號(hào)通路在膽管癌中激活并發(fā)揮重要作用，如 Riedlinger 等[8]通過分析50 例人膽管細(xì)胞癌樣本中 PTCH1、GLI1 和 Shh 的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn) hh 信號(hào)通路成分 GLI1、PTCH1 以及 Shh 在膽管癌樣本中過表達(dá)，使用 hh 信號(hào)通路抑制劑后 CCA 細(xì)胞增殖顯著減少。但該研究僅針對(duì) CCA 細(xì)胞的增殖，而未涉及入侵和遷徙能力，具有一定局限性。El Khatib 等[9]、Tang 等[10]和 Bhuria 等[11]則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)激活 Shh 通路能啟動(dòng) CCA 的 EMT 過程，增加 CCA 細(xì)胞入侵和遷徙能力，彌補(bǔ)了先前的不足。隨著研究的深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)一些lncRNA 在很多癌癥相關(guān)疾病中常呈高水平，并能調(diào)控 hh信號(hào)傳導(dǎo)，下調(diào)其水平能顯著減弱 CCA 的惡性表型。如Guo 等[12]研究發(fā)現(xiàn) ASAP1-IT1 是一種具有致癌作用的lncRNA，敲除或沉默 ASAP1-IT1 會(huì)導(dǎo)致 CCA 細(xì)胞增殖、遷移和 EMT 的減弱。且 smo1 和 GLI1 蛋白水平會(huì)由于ASAP1-IT1 在膽管癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)而下調(diào)，致 hh 信號(hào)通路關(guān)閉，延緩 CCA 進(jìn)程。這些研究均表明 hh 信號(hào)通路和某些 lncRNA 能夠促進(jìn) CCA 的進(jìn)展，抑制 hh 信號(hào)通路的激活及下調(diào)相關(guān) lncRNA 的水平是潛在的治療靶點(diǎn)。

1.2 Hippo 信號(hào)通路

Hippo 信號(hào)通路在腫瘤的信號(hào)傳導(dǎo)、代謝調(diào)節(jié)以及發(fā)生發(fā)展里面扮演著不可忽視的角色[13]，主要通過其核心激酶鏈發(fā)揮效應(yīng)，包括 MOB1、LATS1/2、SAV1 和 MST1/2。當(dāng)通路處于激活狀態(tài)，磷酸化 MOB1 及 LATS1/2 作用于下游效應(yīng)因子 YAP/TAZ，使其在細(xì)胞質(zhì)停留，致下游基因的表達(dá)被阻礙。當(dāng)通路處于關(guān)閉狀態(tài)，YAP 在核內(nèi)激活并誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)[14]。Hippo 信號(hào)傳導(dǎo)能夠把控細(xì)胞生長和凋亡，參與 CCA 的惡性進(jìn)展，且與患者的預(yù)后密切相關(guān)。研究表明在總體生存率上，高 YAP1 的比低 YAP1 差，低 MOB1 低于高 MOB1，且進(jìn)一步分組發(fā)現(xiàn) YAP1 低水平/MOB1 高水平組明顯高于其他 3 組[15]。提示 YAP1 可能發(fā)揮癌基因效應(yīng)且高水平，MOB1 作為抑癌基因低水平，引起 Hippo 信號(hào)改變導(dǎo)致 ICCA 患者預(yù)后不良，但對(duì)于此通路的上游調(diào)控基因尚未涉及。而 lncRNA 與 CCA 在內(nèi)的許多腫瘤的發(fā)展密不可分，且已證明能通過調(diào)控 Hippo信號(hào)傳導(dǎo)增加腫瘤的生長和入侵。如 Li 等[16]發(fā)現(xiàn) lncRNA MNX1-AS1 在 ICCA 細(xì)胞系和組織中水平升高，在體外能增強(qiáng) ICCA 細(xì)胞的擴(kuò)散、侵入能力和血管生成。且主要通過 c-myc 和 MAZ 來增強(qiáng) MNX1 蛋白的表達(dá)，隨后促進(jìn)AJUBA 蛋白水平升高從而抑制 Hippo 通路的活性，導(dǎo)致核內(nèi) YAP1 蛋白的增加，促使 ICCA 的發(fā)生和發(fā)展。

1.3 MAPK 信號(hào)通路

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）包括 c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、p38 MAPK 和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK），在細(xì)胞生物代謝、增殖還有分化方面意義非凡[17]，其異常調(diào)節(jié)在許多癌癥中被證明廣泛存在。已有研究表明，miRNA 與 MAPK 信號(hào)通路串?dāng)_在腫瘤各個(gè)環(huán)節(jié)：細(xì)胞的增殖、遷移[18]。并且 miRNA 能夠下調(diào)下游基因的水平從而阻斷 MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)，延緩CCA 進(jìn)展。例如，Hu 等[19]發(fā)現(xiàn) PTTG1 是 miRNA-329 的靶基因，并且 miRNA-329 能夠通過抑制 PTTG1 的表達(dá)下調(diào) p38 和 ERK5 的磷酸化程度，致 MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)被阻斷，細(xì)胞周期停滯，腫瘤生長擴(kuò)散受到阻礙，凋亡增加。但也有研究報(bào)道 miRNA 會(huì)受其他 ncRNA 的調(diào)控，使其抑制作用減弱甚至消失。如 Kong 等[20]研究發(fā)現(xiàn) miRNA-122能抑制 ERK/MAPK 蛋白的磷酸化，使這條通路失活。但lncRNA-UCA1 可以充當(dāng) miRNA-122 的 ceRNA，抑制miRNA-122 而上調(diào) miRNA-122 下游靶標(biāo)基因 CLIC1 的表達(dá)，ERK/MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)得以激活，CCA 侵入能力及轉(zhuǎn)移增強(qiáng)。

由此看來，一些 miRNA 在 CCA 中充當(dāng)抑癌基因，能阻斷 MAPK 信號(hào)通路發(fā)揮抑癌效應(yīng)，但它們同樣會(huì)因受到其他 ncRNA 的調(diào)控而作用減弱。因此，提高相關(guān)miRNA 水平并切斷其他 ncRNA 對(duì)它們的調(diào)控或許是一種潛在的治療手段。

1.4 mTOR 信號(hào)通路

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Th）蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇-3-激酶相關(guān)激酶（PIKK）家族，對(duì)細(xì)胞代謝、生長、增殖、存活和自噬等生物學(xué)行為具有重要作用[21]。許多癌癥這條通路異?；罨拱┘?xì)胞處于高代謝、高增殖和永生等狀態(tài)。研究表明 lncRNA 在 CCA 中高水平且能增強(qiáng) mTOR 通路活性以增加 CCA 的惡性行為，敲除相關(guān) lncRNA 或能成為一種潛在的治療靶點(diǎn)。如最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在 ICCA 中，lncRNA-HAGLROS 水平升高，與預(yù)后成負(fù)相關(guān)，敲除 HAGLROS 的 ICCA 細(xì)胞系QBC939 細(xì)胞其脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo) TG、LDL-C 和TC 水平顯著降低，而 HDL-C 升高。且脂質(zhì)代謝相關(guān)基因水平降低，并使 mTOR 軸失活和自噬增加，改善了 ICCA 中的脂質(zhì)代謝重編程，抑制了 ICCA 細(xì)胞活力[22]。除敲除 lncRNA 外，研究表明增加抑癌基因 miRNA 的表達(dá)來阻斷 mTOR 通路從而增加 CCA 對(duì)其他藥物的敏感性或許也是一種潛在的治療手段。如 Li 等[23]研究發(fā)現(xiàn) miRNA-199a-3p 的表達(dá)與順鉑敏感性呈正相關(guān)。在順鉑作用下，miRNA-199a-3p 過表達(dá)可降低 CCA 細(xì)胞的增殖率，增加細(xì)胞凋亡，且可失活mTOR 信號(hào)通路來減少多重耐藥性基因 1（multiple drug resistance1，MDR1）的合成和增加 MDR1 的降解來降低順鉑誘導(dǎo)的 MDR1 的表達(dá)，從而增加 CCA 順鉑敏感性，提高順鉑治療膽管癌的療效。

1.5 NF-κB 信號(hào)通路

核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）掌握著細(xì)胞生命的關(guān)鍵密碼，其信號(hào)異常參與了大多數(shù)人類惡性腫瘤的發(fā)病過程，主要是將抗凋亡基因表達(dá)上調(diào)，使癌細(xì)胞免于凋亡[24]。已有研究表明 lncRNA 能夠作為癌基因并通過ceRNA 機(jī)制降低 miRNA 的水平從而增高 NF-κB 通路活性促進(jìn) CCA 惡性進(jìn)展。如 Li 等[25]發(fā)現(xiàn) lncRNA-SNHG1在 CCA 細(xì)胞系中上調(diào)，且以 miRNA-140 為直接靶標(biāo)，通過抑制這個(gè) miRNA 的表達(dá)來增強(qiáng) Toll 樣受體 4（toll-like receptor 4，TLR4）和 NF-κB p65 蛋白表達(dá)，從而使 NF-κB信號(hào)通路得以激活，以促進(jìn) CCA 的進(jìn)展。因此，治療 CCA可考慮以阻礙這條通路為重要手段，研究更多針對(duì) NF-κB的失活劑或者通過敲除、沉默相關(guān) lncRNA 以破壞 ceRNA機(jī)制，使 NF-κB 傳導(dǎo)失活是理論可行的。

1.6 Notch 信號(hào)通路

Notch 級(jí)聯(lián)反應(yīng)存在四種受體（Notch1、2、3、4），參與了細(xì)胞間的信息交流，能對(duì)細(xì)胞的生長、分化和滅亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此在癌癥相關(guān)疾病中處于非正常調(diào)控[26]。兩個(gè)不同團(tuán)隊(duì)均發(fā)現(xiàn)了 Notch1 在人 ICCA 細(xì)胞系或組織中過表達(dá)，并且能夠增強(qiáng) ICCA 的增殖和侵襲[27-28]。此外，ncRNA能夠控制 Notch 信號(hào)通路的激活與關(guān)閉以調(diào)控腫瘤的發(fā)展[29]。例如，Kwon 等[30]研究表明 miRNA-34a 水平在CCA 細(xì)胞下調(diào)，提高 miRNA-34a 水平能夠阻礙 CCA 細(xì)胞的擴(kuò)散和腫瘤的生長，且 miRNA-34a 是以 Notch 信號(hào)通路為靶標(biāo)，阻斷 Notch 信號(hào)傳導(dǎo)來阻礙 CCA 細(xì)胞的擴(kuò)散。因此，Notch 通路可增加 CCA 的惡性表型，直接通過失活劑或者調(diào)控某些 miRNA 的表達(dá)使 Notch 信號(hào)傳導(dǎo)中斷以控制 CCA 的進(jìn)展是一種治療前景。

1.7 PI3K/AKT 信號(hào)通路

磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶-B（PI3K/AKT）信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的生長、分化和代謝具有調(diào)節(jié)作用，在腫瘤中常常被過度激活，且通常伴隨著腫瘤抑制基因 PTEN 的失活[31]。例如在膽管癌研究中，黃利勇等[32]通過分析 47 例膽管癌標(biāo)本，發(fā)現(xiàn) PI3K、AKT 水平升高，PTEN 水平下降，提示 PI3K/AKT 傳導(dǎo)途徑在 CCA 中被激活。此外，有學(xué)者報(bào)道 lncRNA 可作為癌基因或抑癌基因通過調(diào)控此通路的激活與否來加快或阻礙腫瘤的惡性進(jìn)展[33]。如 Wei 等[34]發(fā)現(xiàn) lncRNA SOX2-OT 在膽管癌組織及 CCA 細(xì)胞中水平升高，增強(qiáng)了 CCA 細(xì)胞的生長和擴(kuò)散，且能抑制 PTEN的表達(dá)，激活 PI3K/AKT 傳導(dǎo)途徑，CCA 惡性表型增加。由此可見，沉默或敲除相關(guān) lncRNA 阻礙 PI3K/AKT 的傳導(dǎo)途徑或能成為潛在的治療手段。鑒于此，有研究報(bào)道，lncRNA-MALAT1 在 CCA 細(xì)胞中水平升高，沉默這個(gè)基因則阻礙了 CCA 細(xì)胞系（QBC-939 和 RBE）的擴(kuò)散和侵入能力，減弱了 EMT，且 PI3K 和 AKT 蛋白的磷酸化能通過敲除 MALAT1 而減少，使 PI3K/AKT 因子活化受阻，PI3K/AKT 傳導(dǎo)途徑中斷，CCA 進(jìn)程延緩[35]。此外，也有相關(guān)研究報(bào)道 miRNA 可抑制這條通路，從而發(fā)揮抑制劑效應(yīng)，成為治療 CCA 的一種手段。如 miRNA-885-5p 在ICCA 組織中水平異常下降，提高 miRNA-885-5p 水平減弱了 ICCA 細(xì)胞系的遷徙和侵入能力，并可調(diào)低 GALNT3水平而下調(diào) PI3K/AKT 信號(hào)通路，減少 ICCA 擴(kuò)散[36]。

1.8 TGFβ 信號(hào)通路

轉(zhuǎn)化生長因子 β（transforming growth factor beta，TGFβ）信號(hào)通路被認(rèn)為是生物體內(nèi)的一條重要通路，能夠調(diào)控生物細(xì)胞的生長、分化和細(xì)胞周期，其信號(hào)傳遞可通過活化下游的 Smad 蛋白，從而誘導(dǎo)它在核內(nèi)聚集并作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮效應(yīng)[37]。在腫瘤相關(guān)疾病，TGFβ 可作為效應(yīng)因子，使腫瘤遷移和入侵能力提高，EMT 加強(qiáng)[38]。例如 Huang等[39]通過建立大鼠模型，用短發(fā)夾核糖核酸（shRNA）或藥物抑制 TGFβ1 的活性結(jié)果抑制了 CCA 的增殖和遷移，過表達(dá)則能促進(jìn) CCA 的增殖和遷移，并且這種作用是通過miRNA-34a 介導(dǎo)的。提示 miRNA-34a 在 CCA 中可能發(fā)揮這條通路的抑制劑作用。另一項(xiàng)研究證明了這個(gè)觀點(diǎn)。他們發(fā)現(xiàn) miRNA-34a 在 ECCA 組織和細(xì)胞系中呈低水平，Smad4 是 miRNA-34a 的直接靶標(biāo)，且 miRNA-34a 在體外能拮抗 Smad4 介導(dǎo)的 TGFβ 信號(hào)通路誘導(dǎo)的 EMT，使CCA 的入侵和擴(kuò)散削減[40]?？傊ㄟ^調(diào)節(jié) miRNA-34a 的表達(dá)下調(diào) TGFβ 信號(hào)通路可成為抑制 CCA 惡性轉(zhuǎn)移的一種可行方法。

1.9 Wnt 信號(hào)通路

Wnt 信號(hào)通路被認(rèn)為是生物體內(nèi)特別保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、極性和凋亡，包括經(jīng)典 Wnt 信號(hào)通路（依賴 β-catenin）和非經(jīng)典 Wnt 信號(hào)通路（不依賴β-catenin）[41]。在腫瘤相關(guān)疾病，Wnt 傳導(dǎo)途徑能使腫瘤細(xì)胞的生長、入侵能力和 EMT 得到提高[42]。Zhang 等[43]發(fā)現(xiàn) Wnt、β-catenin 在 CCA 細(xì)胞中高表達(dá)，敲除 Wnt2 或β-catenin，阻斷 Wnt 傳導(dǎo)，可明顯阻礙細(xì)胞生長，增強(qiáng)凋亡。同樣有報(bào)道稱 lncRNA 能作為致癌基因，激活 Wnt傳導(dǎo)而加快 CCA 發(fā)生發(fā)展。Zhang 等[44]實(shí)驗(yàn)顯示lncRNA-PCAT1 在 ECCA 腫瘤標(biāo)本和細(xì)胞中呈高水平，且可作為 miRNA-122 的 ceRNA，使 miRNA-122 水平降低致 Wnt1 的表達(dá)增高，加快 ECCA 細(xì)胞的生長和入侵，抑制凋亡，激活 Wnt/β-catenin 傳導(dǎo)，從而促進(jìn) ECCA 進(jìn)展。但他們的實(shí)驗(yàn)基于體外進(jìn)行，并未進(jìn)行動(dòng)物模型的體內(nèi)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的局限性。與此相反，最近一項(xiàng)研究表明 lncRNA 在 CCA 中也能作為抑癌基因抑制Wnt 信號(hào)通路。Hu 等[45]研究顯示 LncRNA-MIR22HG 在 CCA病理標(biāo)本和細(xì)胞系中水平低，上調(diào)能夠阻礙 CCA 細(xì)胞的擴(kuò)散及侵入，顯著降低了 β-catenin、cyclinD1 和 c-myc 蛋白水平和 mRNA 的表達(dá)，加入外源激動(dòng)劑 SKL2001 顯著減緩了 MIR22HG 上調(diào)誘導(dǎo)的細(xì)胞擴(kuò)散及侵入的抑制作用，表明 MIR22HG 通過負(fù)性調(diào)控 Wnt/β-catenin 傳導(dǎo)途徑來阻礙 CCA 惡性進(jìn)程。

1.10 多信號(hào)通路互作

在 CCA 中，多種通路傳導(dǎo)存在異常，且這些信號(hào)通路并非各司其職，互不關(guān)聯(lián)，而是存在協(xié)同關(guān)系，共同增強(qiáng)CCA 細(xì)胞的遷徙和增殖能力。最近一項(xiàng)研究報(bào)道，lncRNA NNT-AS1 在 CCA 細(xì)胞及組織中高水平，且以 miRNA-203為靶標(biāo)，使其水平下調(diào)致 PI3K/AKT 和 ERK1/2 信號(hào)通路活化，最終使 CCA 細(xì)胞（CCLP1 和 TFK1 細(xì)胞）增殖和EMT 增加[46]。表明 PI3K/AKT 信號(hào)通路和 MAPK 中的ERK 信號(hào)通路在 CCA 細(xì)胞的增殖和 EMT 中具有協(xié)同效應(yīng)并且都可由 lncRNA NNT-AS1 和 miRNA-203 調(diào)控。此外，Kwon 等[30]、Huang 等[39]和 Qiao 等[40]分別發(fā)現(xiàn)了miRNA-34a 能阻礙 Notch 和 TGFβ 信號(hào)傳導(dǎo)，但他們僅單獨(dú)研究了其中一條通路，我們推測 Notch 和 TGFβ 信號(hào)通路在 CCA 中具有協(xié)同關(guān)系，共同增強(qiáng) CCA 細(xì)胞的遷徙和侵入能力，且都能被 miRNA-34a 抑制。但目前還未有相關(guān)報(bào)道，需進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)研究。

2 問題與展望

目前，對(duì)于 ncRNA 調(diào)控 CCA 相關(guān)信號(hào)通路的研究越來越多，但仍有許多研究僅僅基于細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物層面，并未對(duì)臨床 CCA 組織標(biāo)本進(jìn)行分析。而涉及 CCA 組織方面的實(shí)驗(yàn)也還未報(bào)道單獨(dú)針對(duì)早期膽管癌的研究。有研究報(bào)道ncRNA 的表達(dá)量與腫瘤臨床分期、TNM 分期都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，早期膽管癌中是否存在特異性高并參與調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的 ncRNA 是我們需要思考的問題。單獨(dú)對(duì)早期膽管癌進(jìn)行研究，并比較不同 ncRNA 的特異度，對(duì)早期診斷及治療膽管癌具有重要意義。此外，對(duì)于已發(fā)現(xiàn)的ncRNA 及其調(diào)控的信號(hào)通路應(yīng)進(jìn)行深入研究，比較它們單獨(dú)之間及聯(lián)合應(yīng)用的療效，并進(jìn)行臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證臨床治療的可行性。相信隨著科學(xué)迷霧的不斷撥開，膽管癌的診療會(huì)開創(chuàng)新的天地。