羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液中苯甲酸鈉含量的HPLC測定

張東輝，陳玲玲，陳 晨，白玉彬1，董 朕，李 冰，周緒正

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)村農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室 甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050)

羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液屬于創(chuàng)新型復(fù)方制劑，主要用于治療牛、羊吸蟲病、線蟲病，尤其是對肝片吸蟲效果最佳，同時對絳蟲也有一定效果[1-6]。羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液是多劑量包裝口服混懸液，由于口服制劑的特殊性，在生產(chǎn)制備過程中很難完全避免微生物污染，為了保證制劑的安全性，防止藥物變質(zhì)而對患畜造成傷害，需要在處方中加入適量的抑菌劑，以達(dá)到防腐目的[7-9]。目前苯甲酸及其鈉鹽由于抑菌范圍廣，常常作為口服液體制劑的防腐劑[10]，但是隨著苯甲酸鈉的廣泛應(yīng)用，其毒副作用也日漸突出，比如遺傳毒性、生殖毒性、致癌性等[11-14]。國外已經(jīng)開始禁止苯甲酸及其鈉鹽的使用，但在國內(nèi)作為防腐劑仍然廣泛用于食品和藥物制劑中[15]。因此，抑菌劑的合理使用和質(zhì)量控制成為保證藥物安全的關(guān)鍵問題之一[16]，故應(yīng)對其含量進(jìn)行嚴(yán)格控制。本文建立了高效液相色譜法(HPLC)對羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液中的苯甲酸鈉進(jìn)行含量測定，以便控制防腐劑苯甲酸鈉的使用量，保證制劑的安全性，為制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液(批號：20210304、20210305、20210306)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制。

1.1.2 主要試劑 苯甲酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品(批號：100433-201702)，純度99.7%，中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇(色譜純)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品；超純水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司制備。

1.1.3 主要儀器 高效液相色譜儀(Agilent-LC 1290)，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；電子天平(ME403)，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-600DE)，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(MPT-Ⅱ-40L)，上海優(yōu)普實業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；流動相：A相為0.02 mmol/L乙酸銨水溶液-B相為甲醇(85∶15)；檢測波長：224 nm。

1.2.2 溶液配制

(1)供試品溶液：精密量取羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液5 mL，置于100 mL量瓶中，加水溶解超聲10 min并稀釋至刻度，搖勻。離心，取上清液，即為供試品溶液。

(2)對照品溶液：精密稱定苯甲酸鈉對照品12.5 mg，置于25 mL量瓶中，用水超聲溶解并稀釋定容至刻度，充分搖勻，得對照品貯備液。準(zhǔn)確移取對照品貯備液1.0 mL于10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，制成50 μg/mL的苯甲酸鈉對照品溶液。

(3)空白樣品溶液：精密量取不含抑菌劑苯甲酸鈉的羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液5 mL，置于100 mL量瓶中，加水溶解超聲10 min并稀釋至刻度，搖勻。離心，取上清液，即為空白樣品溶液。

1.2.3 專屬性試驗 分別取“1.2.2”項下的對照品溶液、供試品溶液和空白樣品溶液，按“1.2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。

1.2.4 線性關(guān)系 分別精密量取50 μg/mL的苯甲酸鈉對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL量瓶中，用水稀釋定容至刻度，搖勻，制成濃度為2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μg/mL的系列對照品溶液。精密量取10 μL，按“1.2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)，按最小二乘法進(jìn)行線性回歸。

1.2.5 精密度 進(jìn)樣精密度：精密量取“1.2.4”標(biāo)準(zhǔn)曲線下含15.0 μg/mL的苯甲酸鈉對照品溶液10 μL，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)分析6次，記錄色譜峰面積，計算峰面積RSD。

中間精密度：精密量取“1.2.2”供試品溶液6份，由甲、乙兩人分別在不同時間段，使用兩臺不同儀器，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，計算峰面積RSD。

1.2.6 定量限與檢測限 取“1.2.2”項下對照品貯備液逐級稀釋，按“1.2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以信噪比S/N為3時對應(yīng)的濃度為檢測限(LOD)；以信噪比S/N為10時對應(yīng)的濃度為定量限(LOQ)。

1.2.7 溶液穩(wěn)定性試驗 按“1.2.2”方法制備供試品溶液，在室溫條件下放置，分別于0、2、4、6、8、12 h取樣10 μL，按“1.2.1”色譜條件的進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計算峰面積的RSD值。

1.2.8 回收率試驗 精密量取不含抑菌劑苯甲酸鈉的供試品5 mL，置于100 mL量瓶中，共9份，分別加入 “1.2.2”對照品儲備液1.6、2.0、2.4 mL,并用水稀釋定容至刻度，搖勻，作為低、中、高(80%、100%、120%)3個濃度水平的供試品溶液，每個水平平行制備3份。按“1.2.1”條色譜條件進(jìn)樣分析，計算加樣回收率。

1.2.9 樣品含量測定 取羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液3批樣品(批號：20210304、20210305、20210306)，按“1.2.2”條方法制備供試品溶液，按“1.2.1”條色譜條件進(jìn)樣分并計算樣品含量。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗

由圖1可知，在該色譜條件下，空白樣品溶液對苯甲酸鈉的測定無干擾；苯甲酸鈉對照品的保留時間為5.440 min，供試品溶液的保留時間為5.206 min，表明在同一色譜條件下主峰保留時間基本一致，偏差在允許范圍內(nèi)。

A.空白樣品溶液；B.供試品溶液;C.對照品溶液A.Blank sample solution;B.Test solution;C.Control solution圖1 專屬性試驗色譜圖Fig.1 Chromatogram of the specificity test

2.2 線性關(guān)系

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法做線性回歸，得苯甲酸鈉的回歸方程為y=34.24x-5.1681，R2=1。表明苯甲酸鈉在2.5 μg/mL～25.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖2)。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve

表2 精密度試驗結(jié)果Table 2 Precision test results

2.3 精密度

2.3.1 進(jìn)樣精密度 連續(xù)進(jìn)樣6次，其峰面積的RSD小于2.0%，表明儀器精密度良好，儀器較穩(wěn)定。

2.3.2 中間精密度 分別由甲、乙兩個人在不同時間，使用不同儀器連續(xù)進(jìn)樣分析6次，其峰面積的RSD均小于2.0%，表明中間精密度良好。

2.4 定量限與檢測線

試驗結(jié)果表明，當(dāng)S/N為10時，苯甲酸鈉的定量限為0.75 μg/mL；當(dāng)S/N為3時，苯甲酸鈉的檢測限為0.25 μg/mL。

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗

在不同時間段對供試品溶液取樣分析，苯甲酸鈉峰面積的RSD值均小于2.0%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 回收率試驗

由表3結(jié)果可知，苯甲酸鈉的平均回收率為95.90%，RSD<2.0%，證明該方法準(zhǔn)確性好。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

2.7 樣品含量測定

按照上述含量測定方法，對3批羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液供試品進(jìn)行測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果表明，3批樣品中抑菌劑苯甲酸鈉含量均在標(biāo)示量的90%～110%之間，其結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果Table 4 Results of sample content determination

3 討論

參考相關(guān)文獻(xiàn)資料[17]，測定苯甲酸鈉所選用的波長分別為220 nm、230 nm。為了進(jìn)一步確定羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液中抑菌劑苯甲酸鈉的最大吸收波長，采用DAD檢測器對苯甲酸鈉溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苯甲酸鈉的最大吸收波長為224 nm，所以選用224 nm作為檢測波長。

分別考察了不同體系的流動相對供試品中苯甲酸鈉的分離情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各峰分離度和峰形上，乙酸銨-甲醇體系明顯優(yōu)于水-甲醇體系、乙酸銨-乙腈體系；同時又考察了流動相中含不同濃度的乙酸銨對柱效的影響，最后選用0.02 mol/L乙酸銨水溶液-甲醇(85∶15)為流動相，結(jié)果各峰之間分離度良好，且峰形對稱，基線平穩(wěn)。

2015版《獸藥典》四部通則1121抑菌效力檢查法，用于指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)在研發(fā)階段制劑中抑菌劑濃度的確定[18]。通過測定混懸液的抑菌活性，來確定混懸液中防腐劑的最低有效劑量是否添加合理，但對于制劑中防腐劑使用的上限卻無限制[19]。同時對于防腐劑苯甲酸鈉的添加量沒有明確規(guī)定，制劑中防腐劑的添加量主要由研發(fā)企業(yè)自主研發(fā)決定，致使不同廠家的同一制劑中苯甲酸鈉含量差別較大，甚至同一廠家的不同批次中苯甲酸鈉含量也有一定差別[9,10,20,21]。在通則0181項下規(guī)定：口服液體制劑的合劑使用苯甲酸鈉時，用量(以苯甲酸計)不得超過0.3%[18]。為了臨床用藥安全，測定及控制制劑中防腐劑苯甲酸鈉的含量具有重要意義。

目前，有關(guān)HPLC法測定制劑中抑菌劑苯甲酸鈉含量的報道較多，但本方法靈敏度高，操作簡捷，準(zhǔn)確性、專屬性強(qiáng)，適用于羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液中抑菌劑苯甲酸鈉的含量測定，嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量，進(jìn)一步為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。