羊口瘡病毒主要基因組編碼蛋白及其功能

張孟然，叢 瀟，顧月月，劉少冰，劉欣超，李文超，顧有方*

(1.動物營養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點實驗室，安徽鳳陽 233100；2.安徽科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽 233100)

羊口瘡(Orf)學(xué)名傳染性膿皰(Contagious ecthyma dermatitis)，是由羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)或稱傳染性膿皰病毒(Contagious ecthyma virus，CEV)引起的一種接觸性傳染病，別名傳染性膿皰皮炎(Contagious pustular dermatitis)等。綿羊和山羊為主要感染動物，人、貓、狗、駱駝等也可成為易感動物。

ORFV入侵易感動物無毛處和毛發(fā)較少的皮膚上皮細(xì)胞。被感染動物的唇部、眼部、舌頭以及口腔內(nèi)部黏膜出現(xiàn)大小不等的水皰、膿皰和丘疹，最后結(jié)痂痊愈。該病的臨床癥狀與口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)、羊痘(Variola ovina)和小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)等疾病相似。成年羊群中，ORFV的感染率可高達(dá)100%，但致死率只有3%，而羔羊感染后病死率接近100%[1]。成年患病羊可以自愈，但會重復(fù)感染。目前沒有治療和預(yù)防羊口瘡的特效藥，主要通過接種滅活疫苗來控制疾病的傳播。

1 ORF的流行病學(xué)

ORFV易感動物是綿羊和山羊，主要影響羔羊。易感動物經(jīng)過接觸患病動物或患病動物使用過的物品被感染。成年動物感染ORFV高達(dá)90%以上，病死率較低。幼齡動物的病死率幾乎達(dá)到100%。

ORFV也可以感染貓、犬、駱駝等多種動物，在一定條件下會傳染給人，主要人群為牧羊人、農(nóng)民、剪羊毛工人、屠宰場工人和獸醫(yī)[15-18]等與羊密切接觸的行業(yè)。當(dāng)相關(guān)人員的手部有傷口時，沒有及時防范，接觸攜帶ORFV的動物、肉類或人后被感染。ORF呈世界性分布，土耳其、約旦、伊朗、法國、比利時、美國和沙特阿拉伯等國家和地區(qū)每年都會暴發(fā)[19-21]。

2 ORF的病原學(xué)特點

羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)屬于痘病毒科(Poxviridae)、副痘病毒屬(Parapoxvirus)中的一員，病毒顆粒呈卵圓形，大小約為 260 nm×160 nm，相比于其他痘病毒粒子較小。在電鏡下觀察，可見病毒粒子呈螺旋形，縱橫交錯排列。

2.1 基因組序列結(jié)構(gòu)

ORFV是由長為130 kb～160 kb的線性雙鏈DNA構(gòu)成，G+C的含量高達(dá)64%。ORFV包含134個預(yù)測開放閱讀框(opening reading frames，ORFs)，分為中央核心區(qū)(ORFs009-111)和末端區(qū)(ORFs001-008，ORFs112-134)，核心區(qū)的基因相對保守，主要功能是調(diào)控病毒的復(fù)制、包裝和輸出；末端區(qū)域是由兩個反向重復(fù)序列(inverted terminal repeat structure，ITRs)構(gòu)成，主要與病毒的致病性以及免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，具有高度的變異性[2]。

2.2 部分基因及功能

ORFV基因組包含134個基因，一些基因編碼的蛋白功能已被研究，但仍有一些蛋白的功能有待進(jìn)一步研究。核心區(qū)(ORFs009-111)將ORFV基因組分為了兩個末端區(qū)(ORFs001-008，ORFs112-134)，兩個末端區(qū)的基因序列反向重復(fù)。

2.2.1 ORFV011基因 ORFV011 基因也稱為B2L基因，長為1137bp，編碼 379個氨基酸。該基因位于基因組的核心區(qū)，ORFV病毒株的B2L基因同源性較高，表明該基因較為保守，不易發(fā)生突變。B2L基因核苷酸序列同源性為 96.8%～99.7%，氨基酸序列同源性為 97%～99.2%[3]。ORFV入侵宿主細(xì)胞后，B2L基因快速進(jìn)行翻譯。B2L蛋白是 ORFV 囊膜的主要成分，增強(qiáng)病毒毒力，具有脂肪酶活性[28]。此外，B2L 蛋白也是一種棕櫚?；鞍?，刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)和抗體反應(yīng)，通過刺激機(jī)體的相關(guān)淋巴細(xì)胞從而分泌抗體。

2.2.2 ORFV020基因 ORFV020又稱為抗性基因(interferon resistance，VIR)。ORFV入侵動物機(jī)體后，宿主的防御機(jī)制被激活來清除病毒。在病毒與宿主防御系統(tǒng)長時間的對抗下，ORFV進(jìn)化出了一套完整的逃避宿主免疫反應(yīng)的機(jī)制。機(jī)體為抵御和清除入侵的病毒，會產(chǎn)生干擾素(interferon，IFN)。IFN不能直接殺死病毒，而是作用于細(xì)胞表面受體上，使得細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白；同時也可以增強(qiáng)一些免疫細(xì)胞的活力，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，從而增強(qiáng)抗病毒的能力。宿主細(xì)胞在ORFV作用下會產(chǎn)生蛋白激酶(protein kinase，PK)，宿主細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA (double-stranded RNA,dsRNA)和病毒復(fù)制中間體都可以激活蛋白激酶[26]。激活后的蛋白激酶經(jīng)過一系列的化學(xué)反應(yīng)后，限制病毒蛋白翻譯，進(jìn)而抑制病毒復(fù)制。ORFV020基因產(chǎn)生兩種異構(gòu)體，一個是較短的sh20，另一個是全長異構(gòu)體，兩者都可以在體外與dsRNA和蛋白激酶R (protein kinase R,PKR)結(jié)合，導(dǎo)致PKR失活。野生ORFV020只有在體內(nèi)喪失獨立的情況下，可以直接取代sh20[33]。

2.2.3 ORFV059基因 ORFV059基因大小為1 029 bp，是位于核心區(qū)的高度保守基因，也稱為F1L基因，編碼39ku蛋白，是ORFV的主要免疫原性蛋白，病毒感染后的中晚期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。該蛋白是構(gòu)成病毒表面微管不可或缺的部分，對維持病毒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有重要作用，同時可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和中和抗體。該蛋白具有肝素結(jié)合活性，能夠與宿主細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素受體相結(jié)合，此種特性對于病毒吸附以及侵入宿主細(xì)胞的能力有著重要作用[4]。

2.2.4 ORFV117基因 ORFV入侵機(jī)體后，機(jī)體快速做出免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。ORFV117基因是一個重要的免疫調(diào)控基因，該基因編碼產(chǎn)生的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)抑制因子(inhibitorof granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GIF)可以與宿主細(xì)胞因子GM-CSF和白介素-2(interleukin-2，IL-2)結(jié)合并抑制其生物活性[5]。GM-CSF是一個含有174個氨基酸的糖蛋白，機(jī)體中GM-CSF的存在可以促進(jìn) T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的增殖活化及相關(guān)抗原的呈遞[6]。IL-2 是一種源自 T 細(xì)胞的淋巴因子，可刺激 T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)的活化和增殖[7]。GIF在溶液中以二聚體的形式與機(jī)體的GM-CSF或以四聚體形式與機(jī)體內(nèi)IL-2 相結(jié)合。ORFV 編碼的GIF蛋白通過抑制白介素-2和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的功能來阻止白細(xì)胞和樹突細(xì)胞的激活。

2.2.5 ORFV125基因 ORFV125基因與抗細(xì)胞凋亡有關(guān)。正常的機(jī)體會將體內(nèi)衰老、死亡和被病原感染的細(xì)胞及時清理，凋亡是一種程序性死亡，確保細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，并存活在健康的環(huán)境。它對機(jī)體組織發(fā)育和體內(nèi)平衡以及對包括病毒感染在內(nèi)的病理信號的免疫應(yīng)答起著關(guān)鍵作用[8-9]。凋亡一般包括兩種途徑，一種為“死亡配體”與細(xì)胞表面受體(cell surface receptor)結(jié)合導(dǎo)致的凋亡，另一種是由于各種信號傳導(dǎo)給線粒體后引起的凋亡。凋亡會導(dǎo)致半胱天冬氨酸的活化與釋放。線粒體途徑主要是由于線粒體外膜的透化，促凋亡因子(如細(xì)胞色素C)從膜內(nèi)釋放到細(xì)胞質(zhì)中，線粒體的完整性受B細(xì)胞淋巴瘤基因-2 (B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白質(zhì)家族成員的調(diào)節(jié)[10-11]。凋亡前的Bcl-2相關(guān)成員與線粒體膜相互作用，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)釋放，而抗凋亡的則抑制其凋亡前體的活性。ORFV125 基因編碼的蛋白與 Bcl-2 抗凋亡因子的結(jié)構(gòu)相似，通過抑制Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)和Bcl-2同源拮抗劑(Bcl-2 homologous antagonist/killer,Bak)凋亡的激活，因此可以發(fā)揮抗宿主細(xì)胞凋亡的功能。

表1 已知蛋白功能的主要ORFV基因Table 1 Main ORFV genes with known protein functions

2.2.6 ORFV127基因 ORFV127基因長度為558bp，位于基因組的核心區(qū)，各不同病毒株之間的同源性較高。研究發(fā)現(xiàn)，ORFV127所編碼的多肽與哺乳動物白細(xì)胞介素-10(IL-10)和病毒編碼的皰疹病毒IL-10具有顯著同源性[27]。IL-10是一種多功能細(xì)胞因子，對多種細(xì)胞發(fā)揮免疫刺激或免疫抑制作用，也是一種有效的抗炎細(xì)胞因子，對非特異性免疫功能有抑制作用，尤其是對巨噬細(xì)胞功能和Th1效應(yīng)功能有抑制作用。其中抑制Th1效應(yīng)是由于抑制抗原遞呈細(xì)胞(樹突狀細(xì)胞)的成熟和功能而得到的。Fleming[12]等的研究表明，ORFV IL-10刺激小鼠的胸腺細(xì)胞增殖，抑制脂多糖激活的綿羊巨噬細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞因子合成。IL-10活性與ORFV IL-10的研究表明，IL-10在免疫逃避中起到重要作用。

2.2.7 ORFV132基因 ORFV感染會引起皮膚的增生性病變，其中廣泛的血管增生和擴(kuò)張是典型的組織學(xué)特征，此感染表型可能與病毒編碼的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等相關(guān)因子有關(guān)[25]。ORFV血管內(nèi)皮生長因子是由ORFV132基因編碼的病毒早期表達(dá)的毒力因子之一，在不同的毒株中 VEGF 基因有較大的差異。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特有的促分裂原，是血管通透性的強(qiáng)力誘導(dǎo)劑，而且它在新血管的形成中也起著至關(guān)重要的作用[13]。ORFV侵染宿主細(xì)胞后，病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)編碼合成血管內(nèi)皮生長因子，該因子可以刺激血管內(nèi)皮增生及血管通透性的增加，為病毒粒子進(jìn)一步的侵入與復(fù)制奠定基礎(chǔ)。

3 ORFV的主要毒力因子

ORFV通過破損皮膚入侵易感動物的上皮細(xì)胞，在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行生物合成。宿主和病毒相互作用的過程中，病毒不斷地進(jìn)化，使自身毒力和免疫原性增加，獲得逃避宿主清除病毒的能力。

ORFV的毒力因子主要包括病毒血管內(nèi)皮生長因子、ORFV白介素-10、綿羊干擾素抗性蛋白(ovine interferon resistance protein，OVIFNR)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子抑制因子和趨化因子結(jié)合蛋白等幾種抗炎性蛋白。

病毒血管內(nèi)皮因子刺激血管生成和表皮增殖，為病毒復(fù)制提供了底物，趨化因子結(jié)合蛋白通過抑制單核細(xì)胞趨化蛋白-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1a等多種趨化因子抑制免疫細(xì)胞的運轉(zhuǎn)，并在激活的同時調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞的表達(dá)和分泌。ORFV白介素-10通過抑制宿主細(xì)胞因子INF-γ、IL-10和腫瘤壞死因子-α的轉(zhuǎn)錄抑制炎癥反應(yīng)和適應(yīng)性反應(yīng)。GIF結(jié)合并抑制T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的GM-CSF和T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2。綿羊干擾素抗性蛋白的主要功能是抗病毒，抑制IFN[14]。

4 ORF的臨床癥狀

ORFV是一種嗜上皮病毒，由于上皮屏障完整性的喪失，角質(zhì)化皮膚和粘膜表面受致病力較高的ORFV感染。一旦易感動物的皮膚擦傷或受損，ORFV就會乘機(jī)而入。臨床癥狀常表現(xiàn)為唇部、眼部、舌頭以及口腔內(nèi)部黏膜會有大小不等的水皰、膿皰和丘疹，最后結(jié)痂。病灶只會在無毛處和少毛處，不會形成全身性擴(kuò)散，不具有系統(tǒng)性病變。疾病的潛伏期6 d～8 d，是一種急性感染，病程通常為3周～4周[22]。

5 ORF的診斷

羊口瘡與口蹄疫、羊痘和小反芻獸疫等臨床癥狀十分相似，因此會發(fā)生誤診，影響疾病的治療和預(yù)防。分子生物學(xué)方法可更加精準(zhǔn)地檢測出該病毒。

目前，檢測ORFV感染的方法有病毒的分離、電子顯微鏡觀察、血清中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)以及常規(guī)和實時熒光定量PCR等[29]。Wang等[30]通過比較新生牛睪丸支持細(xì)胞系、原代牛睪丸細(xì)胞和牛腎細(xì)胞對ORFV的敏感性，表明新生牛睪丸支持細(xì)胞的敏感性更高。Xu等[31]建立了多重TaqMan PCR，可以在臨床上同時鑒別和檢測山羊和綿羊病毒樣本中小反芻獸疫病毒、口蹄疫病毒、山羊痘病毒和羊傳染性膿皰病毒。Wang等[32]建立了重組酶輔助擴(kuò)增(recombinase aided amplification,RAA)快速檢測ORFV的方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)可在等溫條件下擴(kuò)增DNA序列診斷該病[19，22]。與其他基于核酸檢測方法相比，其優(yōu)點是更簡單、快速、廉價。印度開發(fā)出了一種在單管反應(yīng)中可以同時檢測和區(qū)分羊痘、山羊痘和羊口瘡病毒的多重PCR方法。在不斷的研究中還研發(fā)出了一種基于RNA聚合酶基因序列的數(shù)字液滴PCR檢測ORFV的方法[16，22]。

6 ORFV的防控

由于該病通常在感染后的6周～8周就會自行消失，對患病動物只需進(jìn)行保守治療即可。在患病動物感染部位使用局部的防腐劑預(yù)防繼發(fā)性感染。民間有很多不同的治療方法，如刮除術(shù)、冷療法、電烙術(shù)、咪奎莫特和西多韋弗[14,23-24]。

目前，還沒有普遍認(rèn)可的有效預(yù)防綿羊和山羊ORFV的疫苗。現(xiàn)有的ORFV疫苗是基于患病動物脫落的結(jié)痂或是在培養(yǎng)物中培養(yǎng)出的病毒而研制的。疫苗可以限制ORF的嚴(yán)重程度和感染時間，但是不能使易感動物獲得持久的主動免疫，因此接種過疫苗的動物仍會重復(fù)感染[16,22]。

ORFV也可以作為重組疫苗載體在宿主中表達(dá)外源基因具有潛在的應(yīng)用前景[16]。ORFV作為載體具有的優(yōu)點為病變只局限在皮膚，不會全身性傳播。

7 展望

ORFV研究的最新進(jìn)展對病毒的致病機(jī)制、病毒的進(jìn)化和制作免疫調(diào)節(jié)劑的價值有了新的認(rèn)識。ORFV中參與病毒復(fù)制、免疫抑制和血管生成的多個基因已經(jīng)被研究，但是仍有部分ORFV基因的功能尚不清楚。對ORFV的進(jìn)一步研究可以揭示功能不清的基因，并為人們提供更多關(guān)于病毒進(jìn)化的認(rèn)識。對ORFV免疫逃避的研究可以為開發(fā)出新型ORFV疫苗和防控措施，降低ORF對養(yǎng)殖業(yè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的損失。