夾脊電針對(duì)急性脊髓損傷大鼠炎癥因子表達(dá)的影響

李曉寧,田秀燕,唐祎周△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

脊髓損傷(SCI)是由外部傷害導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病，目前全世界有超過(guò)200萬(wàn)人患有SCI后遺癥，諸如運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)障礙及神經(jīng)源性膀胱和胃腸道功能障礙等[1-3]。脊髓繼發(fā)性損傷是最具破壞性的一種，表現(xiàn)出神經(jīng)炎癥、電解質(zhì)紊亂和興奮性氨基酸中毒等復(fù)雜的病理反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)的持續(xù)性特征是導(dǎo)致患者處于長(zhǎng)期的神經(jīng)功能障礙狀態(tài)的關(guān)鍵因素，如何有效減少炎癥損傷是治療SCI的重點(diǎn)。NLRP3炎癥小體是當(dāng)前炎癥反應(yīng)的研究熱點(diǎn)，作為一類(lèi)多聚體蛋白復(fù)合物，在SCI炎癥反應(yīng)過(guò)程中可引發(fā)炎性細(xì)胞因子的釋放[4-5]。因此，抑制NLRP3炎癥體的活化對(duì)減輕脊髓損傷炎癥損傷、改善神經(jīng)功能至關(guān)重要[6]。本實(shí)驗(yàn)研究采用Allen’s打擊法制備脊髓損傷模型，觀察夾脊電針是否可以抑制NLRP3、IL-1β和IL-18等脊髓損傷相關(guān)炎性因子的表達(dá)，為SCI患者的康復(fù)治療提供重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐和治療方向指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

本實(shí)驗(yàn)中使用的大鼠為SPF級(jí)雌性SD大鼠，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司供應(yīng)，數(shù)量為72只，平均體質(zhì)量為(220±10)g。大鼠所處實(shí)驗(yàn)室照明環(huán)境為每天12 h的照明時(shí)長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)室室溫(23±2)℃，濕度40%～50%。采用隨機(jī)法將大鼠按照類(lèi)別分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(Model組)和夾脊電針組(EA組)，再根據(jù)1 d、3 d、7 d和21 d的治療時(shí)間分為4個(gè)亞組，每組各6只。

1.2 主要試劑和儀器

多聚甲醛(沈陽(yáng)西隴化工有限公司，批號(hào)190823)；水合氯醛(阿拉丁，批號(hào)C101202)；生理鹽水(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)，批號(hào) 200814D08)；注射用青霉素鉀(江西金康佳生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)200802)；顯微鏡(BX53, OLUMPUS，日本)；顯微鏡拍照系統(tǒng)(DP73，OLUMPUS,日本)；超速冷凍離心機(jī)(H-2050R，長(zhǎng)沙，China)；電泳儀(DYY-7C，北京)；電針治療儀(常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司，KWD-808-Ⅱ型)；石蠟切片機(jī)(RM2235，Leica，German)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH36001B，天津泰斯特，天津)；針灸針(0.35 mm×13 mm華佗牌，中國(guó))；鏡拍照系統(tǒng)(OLUMPUS，DP73，日本)；NLRP3(A10511，ABclonal，中國(guó))；全蛋白提取試劑盒(WLA019，wanleibio，中國(guó))；蘇木素-伊紅試劑盒(WLA051a，wanleibio，中國(guó))；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(WLA004，wanleibio，中國(guó))；SDS-PAGE電泳液干粉(WLA026，wanleibio，中國(guó))；PVDF膜(IPVH00010，Millipore，美國(guó))；ECL發(fā)光液(WLA003，wanleibio，中國(guó))。

1.3 造模方法

使用改良Allen’s打擊法造模。首先對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，使用麻醉劑為10%水合氯醛溶液，麻醉注射方式為腹腔注射麻醉(麻醉劑中水合氯醛溶液濃度為3.5 mL/Kg)，對(duì)麻醉后的實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行俯臥位捆綁固定。以大鼠的T10脊髓節(jié)段為中心，去除脊柱附近的皮毛，消毒后用手術(shù)刀沿脊柱正中線，在T10上、下各作約1.5 cm長(zhǎng)的切口，分離皮下筋膜及肌肉組織，清晰暴露T9～T11棘突，剪掉棘突和椎板，完全暴露脊髓組織，將5 g的砝碼消毒后置于玻璃管中，垂直固定于脊髓正上方10 cm，然后垂直落下造成脊髓撞擊傷，此時(shí)可立即觀察到被撞擊的部分迅速充血顏色變深至深紅或紅紫色，同時(shí)大鼠尾部出現(xiàn)一過(guò)性的不自主抽搐，然后止血并且縫合傷口。大鼠醒后評(píng)估其肢體功能，將BBB評(píng)分結(jié)果在1～3分的納入實(shí)驗(yàn)。

假手術(shù)組：僅暴露T9～T11椎板下的脊髓，壓迫止血，隨后不做其他處理，縫合肌肉組織和皮膚。

術(shù)后護(hù)理：大鼠完成夾脊電針治療后，立刻腹腔注射生理鹽水5 mL，每日對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行青霉素肌肉注射，注射頻率為2次/d，共注射3 d。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 電針組 大鼠電針穴位定為T(mén)9和T11兩處穴位，實(shí)驗(yàn)所使針灸針尺寸為0.35 mm×13 mm，直刺腧穴下，深度4～5 mm，感覺(jué)針尖觸碰到椎板，然后同側(cè)夾脊穴接在同一組電針儀上，上接正極，下接負(fù)極，頻率定為100 Hz，電流為大鼠背部肌肉微弱抽動(dòng)，并且沒(méi)有劇烈掙扎即可，每天治療1次，每次30 min。

1.4.2 假手術(shù)組和模型組 僅采用相同方法捆綁，不予任何處置，每日30 min。

1.5 標(biāo)本采集

各組大鼠在1 d、3 d、7 d及21 d分別處置結(jié)束后，用10%水合氯醛溶液進(jìn)行腹腔注射麻醉，大鼠被完全麻醉后，用多聚甲醛灌注進(jìn)行固定，隨后采用冰盒對(duì)脊髓組織進(jìn)行低溫采樣，脊髓組織樣品長(zhǎng)度約4 cm，于4 ℃冰箱存放備用。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)中大鼠脊髓組織HE染色觀察：將脊髓置于多聚甲醛固定液中固定12 h后，分別進(jìn)行后固定、梯度酒精脫水和石蠟包埋后行連續(xù)橫向切片等步驟，最后進(jìn)行HE染色，將染色后樣品進(jìn)行樹(shù)脂封片，使用電子顯微鏡進(jìn)行染色效果的觀察分析，拍照倍數(shù)200×。 免疫組化檢測(cè)各組大鼠脊髓組織中NLRP3、IL-1β和IL-18陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況。Western-blot測(cè)定脊髓組織中NLRP3蛋白表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，相關(guān)計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用ONE-WAY進(jìn)行方差分析，方差齊采用LSD法，方差不齊分析采用Dunnett’s T3法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓組織病理學(xué)觀察

從圖1可知，Sham組脊髓組織切片結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，灰白質(zhì)分界明顯，且神經(jīng)元無(wú)胞體腫脹，光鏡下范圍內(nèi)未觀察到明顯出血區(qū)域。

Model組大鼠在術(shù)后1 d后的HE染色結(jié)果顯示，損傷脊髓組織區(qū)域結(jié)構(gòu)破壞顯著，組織結(jié)構(gòu)疏松，灰白質(zhì)無(wú)明顯界限，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，圖中還可發(fā)現(xiàn)Model組大鼠病態(tài)造血面積及胞漿空泡變性明顯多于EA組。

術(shù)后3 d Model組脊髓出血灶面積較1 d時(shí)降低，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，灰白質(zhì)間隙不明顯，明顯的神經(jīng)元胞體腫脹，Model組胞漿空泡變性及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯多于EA組。

術(shù)后7 d病態(tài)造血面積基本消失，炎性浸潤(rùn)加重，細(xì)胞核花瓣樣核、多核、核畸形和核碎裂現(xiàn)象明顯加重，Model組胞漿空泡變性明顯多于EA組。

術(shù)后21 d灰白質(zhì)界限不可見(jiàn)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較7 d時(shí)稍有減少，紅系前體細(xì)胞成熟障礙較7 d減少，病態(tài)造血面積基本消失，Model組胞漿空泡變性依舊明顯多于EA組，EA組脊髓組織內(nèi)正常神經(jīng)元較Model組數(shù)量增多。

圖1 各組大鼠脊髓組織HE染色結(jié)果(200×)

2.2 各組大鼠脊髓組織中IL-1β、IL-18和NLRP3陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)

大鼠脊髓組織IL-1β表達(dá)結(jié)果：經(jīng)檢測(cè)，與Sham組相比，各時(shí)間點(diǎn)Model組的IL-1β表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Model組相比，在3 d、7 d和21 d時(shí)EA組脊髓組織的IL-1β表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠IL-1β的平均光密度值比較

大鼠脊髓組織中IL-18表達(dá)結(jié)果：與Sham組相比，Model組在各時(shí)間點(diǎn)的IL-18表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)過(guò)電針治療后，與Model組相比EA組脊髓組織在3 d、7 d和21 d的IL-18表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠IL-18的平均光密度值

各組大鼠脊髓組織中NLRP3的表達(dá)：Sham組中NLRP3含量極低，與Sham組比較，Model組大鼠脊髓組織NLRP3蛋白表達(dá)在1 d、3 d、7 d、21 d各個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Model組相比，EA組大鼠脊髓組織NLRP3表達(dá)水平在術(shù)后3 d、7 d、21 d均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠NLRP3的平均光密度值比較

2.3 各組大鼠脊髓組織NLRP3蛋白表達(dá)水平

Sham組中NLRP3的含量極低，與Sham組比較，Model組和EA組大鼠脊髓組織NLRP3蛋白表達(dá)在1 d、3 d、7 d、21 d各個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Model組相比，EA組在3 d、7 d、21 d均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4和圖2。

表4 各組大鼠脊髓組織中NLRP3的蛋白表達(dá)

圖2 各組大鼠脊髓組織NLRP3蛋白表達(dá)(n=6)

3 討論

從中醫(yī)的角度出發(fā)，脊髓損傷這一病癥歸屬于“痿證”范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)·靈樞》曰：“身有所傷，血出多……所有所墮墜，四肢懈惰不收，名為體惰。”，《儒門(mén)事親》云：“四末之疾……弱而不用為痿”，這些與現(xiàn)代脊髓損傷后出現(xiàn)的肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙臨床表現(xiàn)相符。中醫(yī)研究認(rèn)為該疾病的主要產(chǎn)生原因?yàn)槿梭w經(jīng)脈中的督脈受損，經(jīng)脈循行不通，氣血閉阻，人體肌肉和筋脈得不到充盛和濡養(yǎng)，患者表現(xiàn)為痿廢無(wú)力。在人體經(jīng)脈分布中，夾脊穴與督脈和膀胱經(jīng)背俞穴相鄰，對(duì)夾脊穴的針灸刺激可振奮機(jī)體陽(yáng)氣，使患者全身氣血加速流通。研究結(jié)果表明，電針治療可發(fā)揮針刺作用和電刺激作用，電針刺激夾脊穴可以明顯改善急性脊髓損傷患者的神經(jīng)功能[7-9]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為對(duì)夾脊穴進(jìn)行電刺激能有效改善局部缺血缺氧情況，抑制炎癥反應(yīng)等改善神經(jīng)微環(huán)境[10-11]。夾脊穴下分布有脊神經(jīng)，因此夾脊電針通過(guò)對(duì)神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)可對(duì)人體運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能進(jìn)行調(diào)整。目前，研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)研究和分析表明[12-13]，夾脊電針治療的干預(yù)能有效降低SCI后Cleaved caspase-1和IL-1β等多個(gè)因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制組織炎癥反應(yīng)過(guò)程，以達(dá)到促進(jìn)損傷神經(jīng)功能恢復(fù)的目的。

SCI通常由機(jī)械外力引起，隨后發(fā)生的繼發(fā)性損傷包括炎癥、缺血缺氧及脫髓鞘等形成復(fù)雜的微環(huán)境破壞原有的平衡，在此過(guò)程中，神經(jīng)元和其他神經(jīng)細(xì)胞受損后會(huì)分泌大量炎癥因子，起到活化小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的作用，形成局部炎癥微環(huán)境[14]?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明脊髓損傷后的發(fā)生后短時(shí)間內(nèi)，神經(jīng)炎癥是重要因素，在SCI初期，神經(jīng)炎癥有助于限制組織損傷，但是當(dāng)細(xì)胞損傷程度進(jìn)一步發(fā)展時(shí)，神經(jīng)炎癥過(guò)度則會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和壞死[15-16]。

NLRP3炎癥體是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的引起炎癥反應(yīng)、加重局部損傷的重要炎癥因子，NLRP3在SCI繼發(fā)性損傷過(guò)程中起著重要作用。越來(lái)越多的治療SCI相關(guān)研究證明，抑制NLRP3炎癥小體活化，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥，改善由SCI引起的功能障礙[17-19]。Li Na等[14]研究證明SCI大鼠的NLRP3表達(dá)在聯(lián)合治療后顯著下調(diào)，同時(shí)Caspase-1的激活受到抑制，導(dǎo)致IL-1β、IL-18的前體表達(dá)水平降低，從而達(dá)到有效減輕炎癥反應(yīng)目的。抑制NLRP3中炎癥因子的激活以及相關(guān)炎癥蛋白的分泌，能抑制脊髓損傷后炎癥的發(fā)生和發(fā)展[20]。因此，抑制炎癥、促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)是治療SCI有效途徑。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察夾脊電針對(duì)大鼠SCI的影響，發(fā)現(xiàn)夾脊電針可以明顯改善大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能，電針后脊髓組織的病理形態(tài)學(xué)充血和結(jié)構(gòu)損傷有所緩解，脊髓炎癥損傷程度具有明顯好轉(zhuǎn)趨勢(shì)。

綜上所述，脊髓損傷后對(duì)相應(yīng)夾脊穴位行電針治療，能夠有效抑制NLRP3、IL-18和IL-1β的表達(dá)，從而減少炎癥反應(yīng)，改善微環(huán)境，緩解脊髓損傷。現(xiàn)有治療脊髓損傷的藥物和方法十分有限，NLRP3炎癥體是目前治療脊髓損傷、探討機(jī)制的靶點(diǎn)和熱點(diǎn)，夾脊電針對(duì)NLRP3炎癥體的激活及其他細(xì)胞因子和途徑，可以從不同的激活方式進(jìn)一步深入研究。