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    銀杏內(nèi)酯C標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制

    2022-04-08 05:34:22寧凡盛路巖翔曹桂云孟兆青閆慧嬌王岱杰
    山東科學(xué) 2022年2期
    關(guān)鍵詞:銀杏葉定值內(nèi)酯

    寧凡盛,路巖翔,曹桂云,孟兆青,閆慧嬌,王岱杰

    (1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)a.山東省分析測試中心; b.藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250014;2.濟(jì)南市行政審批服務(wù)局,山東 濟(jì)南 250001;3.山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司,山東 濟(jì)南 250000)

    銀杏葉由銀杏科植物銀杏GinkgobilobaL.的葉子干燥而成[1],是目前中藥常用品種,具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、斂肺平喘、化濁降脂的功效[2-5]?,F(xiàn)代藥理研究表明,銀杏葉提取物能夠抗氧化、抗衰老、降血壓、促進(jìn)血液循環(huán)、提高腦部功能[6-8]。銀杏內(nèi)酯C是銀杏葉中主要的活性成分,是控制藥材質(zhì)量和成藥標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)[9-11]。銀杏內(nèi)酯是一類具有特殊分子結(jié)構(gòu)的二萜內(nèi)酯類化合物,銀杏葉制劑的療效和內(nèi)在質(zhì)量是由銀杏內(nèi)酯的含量決定的[12]。目前國內(nèi)市場上的銀杏內(nèi)酯C以對照品為主,純度在85%~98%,級別參差不齊,未按照國標(biāo)的要求對其進(jìn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品評測,樣品不具有溯源性[13-16]。為滿足銀杏、銀杏葉及其他含有銀杏內(nèi)酯C藥材的成分分析、樣品檢測、質(zhì)量控制等需求,保證結(jié)果的可比性、準(zhǔn)確性和溯源性[17],急需對銀杏內(nèi)酯C進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備研究。

    GB/T 15000.2—2019《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則第2部分:常用術(shù)語及定義》[18]中關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)樣品的定義是:足夠均勻的一種或多種,具有化學(xué)的、物理的、生物學(xué)的、工程技術(shù)的或感官的等性能特征,經(jīng)技術(shù)鑒定,附有說明相關(guān)性能數(shù)據(jù)證書的樣品。標(biāo)準(zhǔn)樣品可以對儀器進(jìn)行校準(zhǔn),對相關(guān)測量方法進(jìn)行評價和對材料賦值[19-22]。天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品是天然產(chǎn)物質(zhì)控方面確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量不可或缺的參照物,具有高度均勻性和良好的穩(wěn)定性。但我國目前已研發(fā)出的天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品,無論在種類還是在數(shù)量上均嚴(yán)重不足,直接給相關(guān)產(chǎn)品的檢驗(yàn)和檢測帶來困擾,同時還制約了相關(guān)檢測和質(zhì)控行業(yè)的發(fā)展[23]。本文為解決銀杏內(nèi)酯C標(biāo)準(zhǔn)品缺乏的問題,參照GB/T 15000.3—2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)樣品 定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》[24],成功研制出滿足國家標(biāo)準(zhǔn)的銀杏內(nèi)酯C樣品,其結(jié)構(gòu)見圖1。

    圖1 銀杏內(nèi)酯C的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

    1 儀器與材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

    DZKW-C恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-3(瑞士Buchi公司)配有V-700真空泵(瑞士Buchi公司);DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);Shimadzu LC-6AD高效液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司);Agilent 1220高效液相色譜儀(美國Agilent科技公司);島津TG-40 DTA-40M 熱重分析儀(日本Shimadzu公司);Elementar全自動元素分析儀vario EL III(德國Elementar公司);SP-20E型全自動點(diǎn)樣儀(上海科哲生化科技有限公司);WRS-1B數(shù)字熔點(diǎn)儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司);UV-2700紫外可見分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司);Agilent 6520 Q-TOF四極桿聯(lián)用飛行時間質(zhì)譜(美國Agilent科技公司);INOVA 400 MHz核磁共振波譜儀(美國Varian公司)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)材料

    無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,瑞典Oceanpak試劑公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水;柱層層析硅膠(100~200目)(青島鼎康硅膠有限公司);Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(Amersham Biosciences公司);G254薄層硅膠板(青島海洋化工廠)。

    實(shí)驗(yàn)所用銀杏葉均購自濟(jì)南建聯(lián)中藥店,由山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為銀杏科植物銀杏GinkgobilobaL.的干燥葉。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 樣品的制備

    2.1.1 樣品的提取

    2.1.2 樣品的純化

    制得的銀杏內(nèi)酯C經(jīng)冷凍干燥得到白色粉末,用4 mL棕色瓶進(jìn)行分裝,每瓶10 mg(十萬分之一天平稱量),分裝好的樣品瓶放在4 ℃冰箱中長期保存。

    2.2 純度分析方法

    2.2.1 高效液相色譜分析

    將制備得到的高純度銀杏內(nèi)酯C溶于甲醇,配制質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的溶液,使用配有蒸發(fā)光檢測器的高效液相色譜儀(HPLC-ELSD)檢測,柱溫設(shè)置25 ℃,進(jìn)樣15 μL,流速為1.0 mL/min。ELSD檢測條件:漂移管溫度105 ℃,氣體流速3.5 L/min,增益值為1。等度色譜條件:色譜柱Nano-micro C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動相乙腈(A)-水(B),0~30 min,32%A;運(yùn)行時間30 min。梯度色譜條件:色譜柱Nano-micro C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動相乙腈(A)-水(B);梯度:0~30 min,10%~100%A,30~35 min,100%A。

    等度色譜分析結(jié)果顯示扣除溶劑峰后,樣品純度高于98%;梯度色譜分析結(jié)果顯示30~35 min未有明顯雜質(zhì)峰出現(xiàn),證明樣品是單一的、純度高于98%的銀杏內(nèi)酯C。色譜分析結(jié)果見圖2。

    圖2 銀杏內(nèi)酯C HPLC圖譜

    2.2.2 薄層鑒別

    點(diǎn)樣結(jié)果表明,樣品在兩個展開體系中均呈現(xiàn)單一棕黃色斑點(diǎn),Rf值分別為0.50(展開劑I)和0.31(展開劑II),樣品向上延展的路徑中沒有明顯雜質(zhì)斑點(diǎn)出現(xiàn)。薄層色譜圖見圖3。

    圖3 薄層色譜圖

    2.2.3 液質(zhì)聯(lián)用純度分析

    色譜柱Nano-micro C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫30 ℃;流速1.0 mL/min;流動相乙腈(A)-水(B);梯度洗脫條件0~30 min,10%~100%A;運(yùn)行時間30 min。質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源(ESI),掃描范圍為m/z=100~1000,載氣為高純度氮?dú)?,氣體流速為10 L/min,載氣溫度設(shè)置300 ℃,毛細(xì)管電壓為4.0 kV。

    液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)分析結(jié)果表明,正離子和負(fù)離子模式下的總離子流圖均未見明顯雜質(zhì)峰存在??傠x子流圖見圖4。

    圖4 銀杏內(nèi)酯C總離子流圖

    2.2.4 熱重分析

    精密稱定銀杏內(nèi)酯C樣品5.0 mg于熱重分析(TG)用坩堝中,熱重條件初始溫度30.0 ℃,最終溫度600.0 ℃,升溫速率10 ℃/min,流量100 mL/min,氣體為氮?dú)狻?/p>

    分析結(jié)果表明,在溫度28.1~298.5 ℃范圍內(nèi),樣品的熱重曲線是一條直線(無明顯變化),說明銀杏內(nèi)酯C中基本不含有吸附水和易揮發(fā)性物質(zhì),熱穩(wěn)定性良好。當(dāng)溫度上升至353.4 ℃時,樣品開始分解。TG曲線見圖5。

    圖5 銀杏內(nèi)酯C的TG曲線

    2.3 結(jié)構(gòu)確認(rèn)

    銀杏內(nèi)酯C的結(jié)構(gòu)確認(rèn)采用4種常見光譜技術(shù)(紫外、紅外、質(zhì)譜和核磁共振技術(shù))。紫外分析法(UV)以甲醇為測試溶劑,掃描范圍為190~640 nm。紅外分析法(IR)使用KBr壓片液膜,掃描范圍為400~6 000 cm-1,采樣速率為80張/s。質(zhì)譜分析法(MS)使用高分辨質(zhì)譜,離子源為ESI離子源,載氣為普通氮?dú)?,錐孔氮?dú)饬魉?0 L/min,載氣溫度350 ℃,毛細(xì)管電壓4.0 kV,掃描范圍m/z=100~1 500。核磁共振分析法(NMR)氘代溶劑為DMSO,采集1H譜和13C譜。

    圖6 銀杏內(nèi)酯C的UV譜圖

    圖8 銀杏內(nèi)酯C質(zhì)譜圖

    表1 銀杏內(nèi)酯C的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)

    以上各項(xiàng)光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道的銀杏內(nèi)酯C基本一致,化合物結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果為銀杏內(nèi)酯C。

    2.4 均勻性檢驗(yàn)

    按照工作導(dǎo)則中均勻性檢驗(yàn)的要求,采用隨機(jī)抽取、重復(fù)測量的方法,從分裝好的樣品中隨機(jī)抽取10瓶,按照3種抽取方式(第一次抽樣為1、3、5、7、9、2、4、6、8、10號瓶;第二次抽樣為10、9、8、7、6、5、4、3、2、1號瓶;第三次抽樣為2、4、6、8、10、1、3、5、7、9號瓶),然后從每瓶中精密稱定1.5 mg樣品3份,用色譜甲醇溶解定容至1 mL容量瓶備用,按照2.2.1項(xiàng)下等度色譜條件對每個樣品進(jìn)行測定,以樣品峰面積的百分比讀取樣品純度,數(shù)據(jù)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)和方差分析,計(jì)算出F值,以確定銀杏內(nèi)酯C的均勻性是否良好,檢驗(yàn)結(jié)果見表2~3。

    表2 均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)

    表3 方差分析數(shù)據(jù)

    (1)

    瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算:

    (2)

    u均=Sbb=0.008。

    (3)

    F值計(jì)算:

    F=SM間/SM內(nèi)=2.04。

    (4)

    以υ1(即組間)=9及υ2(即組內(nèi))=20,查詢F界值表,得F0.05(9, 20)=2.94,由于F=2.04<2.94,說明銀杏內(nèi)酯C的均勻性良好。

    2.5 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

    將銀杏內(nèi)酯C儲存在0~4 ℃,考察樣品2年的穩(wěn)定性。分5個時間段考察,按2.2.1項(xiàng)下等度條件進(jìn)行分析,使用峰面積百分比對樣品純度進(jìn)行計(jì)算。每個樣品復(fù)測5次,采用t檢驗(yàn)法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算穩(wěn)定性的不確定度[26],分析結(jié)果見表4。

    表4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果

    斜率計(jì)算:

    (5)

    截距計(jì)算:

    (6)

    直線模型的標(biāo)準(zhǔn)偏差:

    (7)

    將s=0.017代入公式,斜率相關(guān)的不確定度:

    (8)

    u穩(wěn)=s(b1)×t=0.001×24=0.024。

    (9)

    查表得,自由度為(n-2)和95%置信水平(p=0.95)的t0.95,n-2=3.182,由于|b1|

    上述計(jì)算結(jié)果說明,銀杏內(nèi)酯C樣品在2年內(nèi)的長期穩(wěn)定性好。

    2.6 定值分析

    按照標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則GB/T 15000.3—2008的要求,選取8個實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行定值實(shí)驗(yàn),隨機(jī)抽取24瓶樣品,每個實(shí)驗(yàn)室分配3瓶,每瓶樣品進(jìn)行2次平行測定。采用高效液相色譜法測定樣品純度,利用各實(shí)驗(yàn)室的純度數(shù)據(jù)計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差,進(jìn)行定值實(shí)驗(yàn)。銀杏內(nèi)酯C純度定值結(jié)果匯總?cè)绫?所示。

    表5 協(xié)作定值數(shù)據(jù)匯總

    測定結(jié)果總平均值的計(jì)算:

    (10)

    各實(shí)驗(yàn)室平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差:

    (11)

    總平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差:

    (12)

    多家定值的不確定度:

    (13)

    標(biāo)準(zhǔn)樣品的不確定度由以下3部分組成:(1)均勻性檢驗(yàn)的不確定度(u均=0.008%),(2)穩(wěn)定性檢驗(yàn)的不確定度(u穩(wěn)=0.024%),(3)多家定值的不確定度(u定=0.014%)。需通過這3部分不確定度合成計(jì)算得到合成不確定度(u合成),

    u合成=0.03%。

    當(dāng)置信區(qū)間95%時,k=2,擴(kuò)展不確定度uCRM=2u合成=0.06%。

    3 結(jié)論

    本研究嚴(yán)格按照GB/T 15000.3—2008的要求,對銀杏內(nèi)酯C進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)品建立所需要的實(shí)驗(yàn),即均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)和定值分析,根據(jù)這三個方面進(jìn)行了不確定度的合成和擴(kuò)展,獲得了定值純度為(99.85±0.06)%的銀杏內(nèi)酯C國家標(biāo)準(zhǔn)樣品。該標(biāo)準(zhǔn)樣品可用于銀杏內(nèi)酯C的含量測定、純度檢測與質(zhì)量控制,為銀杏、銀杏葉及其他含有銀杏內(nèi)酯C藥材的成分分析、樣品檢測、科學(xué)研究和產(chǎn)品開發(fā)提供了技術(shù)支撐和溯源保證。本實(shí)驗(yàn)為天然產(chǎn)物研制成國家標(biāo)準(zhǔn)樣品起到了補(bǔ)充效果,填補(bǔ)了銀杏內(nèi)酯C標(biāo)準(zhǔn)樣品在國內(nèi)外的空白。

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