基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究三七抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制

張瀟文，應(yīng)天昊，梁美辰，王艷芳，王信林，張雷明

(煙臺(tái)大學(xué) 藥學(xué)院 分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264005)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種全身性自身免疫性疾病，屬于中醫(yī)學(xué)“痹癥”的范疇，其主要臨床表現(xiàn)為侵蝕性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎。目前，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、血管翳形成，并逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞，后期發(fā)展為進(jìn)行性關(guān)節(jié)損傷、功能喪失合并癥[1]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可見于各個(gè)地區(qū)和種族，目前患病人數(shù)約占世界總?cè)丝诘?.0%[2]。

中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)以及整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，相比于傳統(tǒng)化學(xué)藥物的治療，中藥對(duì)RA的治療具有一定的優(yōu)勢(shì)，臨床實(shí)踐證明，無(wú)論內(nèi)服、外用、單方或聯(lián)合等中醫(yī)藥治療都取得了明顯療效。中醫(yī)藥治療避免了化學(xué)藥的毒副作用，適宜長(zhǎng)期服用，具有明顯優(yōu)勢(shì)[3]。三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)為五加科人參屬植物三七的干燥根，具有抗血栓、抗炎、抗纖維化、調(diào)節(jié)免疫等作用，逐步被應(yīng)用于臨床，其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療方面也越來越受重視[4]。三七的藥理作用主要體現(xiàn)在對(duì)血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等的影響[5]。三七的主要活性成分為三七總皂苷[6]，具有抗炎、改善細(xì)胞能量代謝、清除自由基及抗氧化應(yīng)激、調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、平衡離子代謝紊亂、改善組織血流供應(yīng)等藥理作用[7-12]，臨床上常用于治療心腦血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病,亦可用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫疾病[13]。

運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究中藥的結(jié)構(gòu)、功效，彌補(bǔ)了以往中藥研究中單靶點(diǎn)、單通路的思維缺陷。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法揭示三七抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制，為新藥研發(fā)及深入研究三七的作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 三七活性成分及其作用靶點(diǎn)的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索三七的主要成分，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%及類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18為篩選條件，獲得三七的主要活性成分。通過主要活性成分的編號(hào)(MOLID)，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)靶點(diǎn)檢索功能(related targets)檢索主要活性成分的潛在靶點(diǎn)，去除沒有檢索到靶點(diǎn)的活性成分，依次得到7種主要活性成分對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)。篩選結(jié)束后，統(tǒng)一應(yīng)用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)將活性成分作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范，標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息，以便后續(xù)研究。

1.2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)中檢索類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中，Score值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系越密切。

1.3 三七活性成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎交集靶點(diǎn)篩選

利用R語(yǔ)言將三七活性成分作用靶點(diǎn)和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用靶點(diǎn)取交集并繪制維恩圖，兩者交集部分即為三七抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 三七活性成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模型，將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 三七活性成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)生物功能與通路的富集分析

Metascape平臺(tái)(http://metascape.org)可對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺(tái)進(jìn)行GO(gene ontology)及KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析，設(shè)置P< 0.01，分析其主要的生物學(xué)過程與代謝通路并進(jìn)行富集分析，保存其結(jié)果并通過R語(yǔ)言對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.6 三七活性成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建三七活性成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytoscape 3.7.2內(nèi)置工具分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度(degree)、介度(betweenness)及緊密度(closeness)等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷核心靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.7 分子對(duì)接

從PPI及成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖中選取關(guān)鍵靶點(diǎn)分別與關(guān)鍵成分進(jìn)行分子對(duì)接，驗(yàn)證成分與靶點(diǎn)之間的可能性。從 Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索獲得受體蛋白(PDBID: 1UNQ)，利用AutoDock Vina 1.1.2對(duì)受體蛋白與配體小分子進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)結(jié)合自由能進(jìn)行打分。

2 結(jié)果

2.1 三七的活性成分及其作用靶點(diǎn)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)OB和DL參數(shù)篩選初步獲得8個(gè)成分，剔除1個(gè)未查詢到靶點(diǎn)的成分，最終獲得7個(gè)活性成分(表1)。對(duì)上述7個(gè)成分作用靶點(diǎn)加以預(yù)測(cè)，得到三七活性成分作用靶點(diǎn)202個(gè)，刪除重復(fù)值后共得到靶點(diǎn)154個(gè)。利用Cytoscape 3.7.2對(duì)三七活性成分及其作用靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行繪制和分析，共獲得161個(gè)節(jié)點(diǎn)(包含154個(gè)靶點(diǎn)和7個(gè)活性成分)與202條邊，圖中節(jié)點(diǎn)的大小代表相應(yīng)的連接度值，節(jié)點(diǎn)面積越大代表連接度值越大，表示涉及的生物功能越多，其生物學(xué)重要性越高(圖1)。

表1 三七活性成分

注: 圖中紫色代表活性成分作用的靶點(diǎn)；黃色代表7個(gè)活性成分。

2.2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)

從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)4 465個(gè)。設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)，如通過GeneCards所得類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)Score最大值為110.06，最小值為0.15，中位數(shù)為1.44，故設(shè)定Score ≥1.44的靶點(diǎn)為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)，最終得到2 237個(gè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 三七活性成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用R語(yǔ)言將三七活性成分和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的作用靶點(diǎn)取交集，繪制維恩圖(圖2)，得到交集靶點(diǎn)100個(gè)，即三七活性成分抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用的潛在靶點(diǎn)。

圖2 三七活性成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)維恩圖

2.4 三七活性成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選得到的三七活性成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎100個(gè)交集靶點(diǎn)提交至 STRING 11.0平臺(tái)，限定物種為“人”，選擇交互作用大于0.4的靶點(diǎn)得到三七靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖數(shù)據(jù)。為了更加清楚地體現(xiàn)核心蛋白在PPI中的調(diào)控作用，通過Cytoscape 3.7.2進(jìn)行可視化分析并通過內(nèi)置的Network Analyzer分析得到最終PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)。共有98個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 751條邊。圖中節(jié)點(diǎn)大小和顏色表示靶點(diǎn)的度值，節(jié)點(diǎn)越大，顏色由淺黃到橙色，表示靶點(diǎn)連接度值也就越大，反之表示越小。由圖3可以看出，AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、JUN、CASP3、PTGS2等目標(biāo)基因位于網(wǎng)絡(luò)的核心位置，在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。

圖3 三七-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 三七抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎潛在靶點(diǎn)生物功能與通路的富集分析

利用Metascape平臺(tái)，將三七活性成分與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO的生物過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和細(xì)胞組分(cell component, CC)富集分析，將P<0.01的項(xiàng)目進(jìn)行篩選，總共富集到1 791條生物過程，131項(xiàng)分子功能相關(guān)，66項(xiàng)細(xì)胞組分相關(guān)。使用R語(yǔ)言按照富集的顯著程度取排名前10的項(xiàng)目進(jìn)行柱狀圖繪制(圖4)。KEGG通路分析按P<0.01進(jìn)行篩選，總共富集到304條信號(hào)通路，篩選排名前20的通路進(jìn)行氣泡圖繪制(圖5)。

圖4 GO分析

圖5 KEGG通路富集分析

2.6 三七活性成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建三七成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)(圖6)。通過 Cytoscape 3.7.2內(nèi)置的Network Analyzer分析三七治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，得到核心成分及核心作用靶點(diǎn)。三七治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的核心成分為槲皮素、人參皂苷rh2和β-谷甾醇等(表2)，最主要靶點(diǎn)為AKT1、RELA、MAPK1、CHUK、IL6、CASP3、JUN、NFKBIA、TNF、TP53等(表3)。

注:不同顏色的圓形節(jié)點(diǎn)為不同藥物的活性成分，矩形為靶點(diǎn)，倒三角為通路；節(jié)點(diǎn)的面積及顏色透明度其代表其度數(shù)，面積越大、顏色越深說明該節(jié)點(diǎn)越重要。

表2 三七主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

表3 三七主要活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

2.7 分子對(duì)接結(jié)果

使用AutoDock Vina軟件對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)和成分進(jìn)行分子對(duì)接后，得到結(jié)合自由能打分，如表4所示，能值越低，表明二者的結(jié)合效果越好。表中AKT1與人參皂苷rh2和豆甾醇結(jié)合性最好，如圖7所示，從圖中可以看出AKT1與兩種成分相互作用，結(jié)合后呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)。

表4 與關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1的對(duì)接結(jié)果

圖7 化學(xué)成分與AKT1的分子對(duì)接圖

3 討論

本研究篩選得到的活性成分主要有槲皮素、人參皂苷rh2、β-谷甾醇、豆甾醇、亞油酸乙酯、甘草素。槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，廣泛存在于植物的花、葉、果實(shí)中，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗纖維化等藥理作用[14]，可以減輕大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的踝關(guān)節(jié)腫脹程度，并且能夠降低炎癥因子IL-1β、TNF-α、COX-2、NO的水平[15]，提示其具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛力。人參皂苷Rh2具有抗氧化和抗炎的作用[16]，可以顯著抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α[17]，并且可以減少肺組織中LPS誘導(dǎo)的促炎性NO、腫瘤壞死因子-α的分泌，降低白介素IL-1β和IL-4、IL-6和IL-10水平[17]。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，屬于四環(huán)三帖類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血脂等藥理作用[18]。豆甾醇是植物甾醇之一，常和油脂共存于許多植物種子和花粉中，能抑制多種炎癥介質(zhì)，從而減少骨關(guān)節(jié)炎引起的軟骨退化，并可以通過阻斷IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB通路來發(fā)揮其抑制作用[19]。亞油酸乙酯是人體必需脂肪酸之一，有降低血清膽固醇和低密度脂蛋白、抗菌、抗炎等藥理作用，可用于治療動(dòng)脈硬化、心絞痛等。亞油酸乙酯對(duì)鈦顆粒和LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性因子的釋放均有抑制作用，從而可以減輕炎癥反應(yīng)[20-21]。甘草素是從中藥甘草中提取的一種黃酮類化合物單體，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用[22]，對(duì)LPS誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[23]。

本研究篩選得到三七-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎共同作用靶點(diǎn)100個(gè)，其中核心靶點(diǎn)包括AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、JUN、CASP3、PTGS2。為了進(jìn)一步研究共同作用靶標(biāo)在基因功能和信號(hào)通路方面的作用，進(jìn)行了GO分析和KEGG分析。GO分析共獲得1064條信號(hào)通路，KEGG分析獲得102條信號(hào)通路，其中與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的信號(hào)通路包括AGE-RAGE、MAPK、TNF、IL-17以及HIF-1等。AGE(糖基化終產(chǎn)物)-RAGE(糖基化終產(chǎn)物受體)信號(hào)通路在糖尿病及其并發(fā)癥的形成與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，AGEs可以激活RAGE，會(huì)引起輕度全身性炎癥反應(yīng)和氧化作用[24]，三七皂苷等復(fù)方制劑可以降低AGE和RAGE的表達(dá)[25]。MAPK信號(hào)通路被激活后會(huì)產(chǎn)生大量促炎性細(xì)胞因子和MMP(基質(zhì)金屬蛋白酶)，促進(jìn)成纖維樣細(xì)胞的遷移和侵襲，導(dǎo)致滑膜炎癥、關(guān)節(jié)破壞[26-27]。TNF信號(hào)通路中，TNF-α能促進(jìn)軟骨破壞，加重炎性反應(yīng)，促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎活動(dòng)期及進(jìn)展期，TNF-α表達(dá)明顯增加[28]。IL-17信號(hào)通路是Th17細(xì)胞活化和維持的關(guān)鍵通路，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種炎癥性疾病中，尤其是在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)癥狀的形成中發(fā)揮重要作用[29-30]。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β組成，HIF-1α在小鼠膝關(guān)節(jié)炎中表達(dá)明顯升高[31]。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接闡釋了三七的活性成分、靶點(diǎn)及通路之間相互作用的關(guān)系，三七的活性成分可通過多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎效應(yīng)，為三七治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的開發(fā)及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。