磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉通過miR-133b/ELAVL1分子軸緩解小兒病毒性心肌炎的機制研究Δ

蔡昌君，黃惠敏，桂冬梅，尹楊艷

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，?？?570100)

病毒性心肌炎是一種彌漫性或局限性的心肌病變，通常由嗜心肌病毒感染所致[1]。由于小兒免疫系統(tǒng)尚在發(fā)育，抵抗能力較差，因此極易被病毒感染，罹患病毒性心肌炎[2]。經(jīng)過長期臨床實踐發(fā)現(xiàn)，磷酸肌酸鈉和果糖二磷酸鈉用于小兒病毒性心肌炎的治療，可發(fā)揮良好的療效[3-4]。也有臨床研究結(jié)果證實，磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉對小兒病毒性心肌炎的療效更佳[5]。但鮮有研究探討上述聯(lián)合用藥的分子機制。微RNA(miRNA)為廣泛存在于機體中的非編碼RNA，與人類的多種疾病密切相關(guān)[6]。作為疾病標(biāo)志物，異常上調(diào)或下調(diào)的特定miRNA可能參與調(diào)控疾病的發(fā)生及發(fā)展過程，其中也不乏針對病毒性心肌炎的相關(guān)報道[7]。也有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，調(diào)控機體中的miRNA是藥物發(fā)揮作用的方式之一[8]?；谏鲜鲅芯炕A(chǔ)，柯薩奇病毒B組(CVB)作為引發(fā)病毒性心肌炎的病毒之一，已被廣泛用于構(gòu)建病毒性心肌炎模型[9]。心肌肌鈣蛋白T(cTnT)為心肌肌肉收縮的調(diào)節(jié)蛋白，其濃度會在心肌受到損傷后顯著升高；肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平明顯升高時，提示心肌損害；此外，心肌炎是以炎癥性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的疾病，腫瘤壞死因子α(TNF-α)為涉及系統(tǒng)性炎癥的細胞因子，白細胞介素6(IL-6)為機體抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用的淋巴因子，兩者的水平也與心肌炎的病程密切相關(guān)。因此，本研究探討了磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉對小兒病毒性心肌炎心肌損傷標(biāo)志物(cTnT和CK-MB)、炎癥因子(TNF-α和IL-6)水平的影響，同時篩選出受磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉影響顯著的miRNA，并進一步通過柯薩奇病毒B組3型Nancy株(CVB3)感染心肌細胞，構(gòu)建病毒性心肌炎細胞模型，從細胞水平探討磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉發(fā)揮治療效果的分子機制，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料來源

依據(jù)《病毒性心肌炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》，將2018年1月至2020年1月就診于我院的符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的2～6周歲病毒性心肌炎患兒120例作為研究對象，主要臨床表現(xiàn)為腹瀉、發(fā)熱、心悸和氣促。診斷標(biāo)準(zhǔn)為血清柯薩奇病毒陽性，并符合以下輔助改變之一：(1)心功能不全；(2)心臟擴大，室壁運動彌漫性降低；(3)心電圖檢查顯示，以R波為主的2個以上主要導(dǎo)聯(lián)ST-T段改變，低電壓(新生兒除外)出現(xiàn)異常Q波。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡2～6周歲；無先天性心臟病或心臟畸形。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有嚴(yán)重器官功能障礙者；合并免疫系統(tǒng)疾病、代謝系統(tǒng)疾病者；其他類型心肌炎者。本研究獲得我院倫理委員會審批通過(審批號：20171215076)。根據(jù)給藥情況，將患兒分為磷酸肌酸鈉組、果糖二磷酸鈉組和磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組，每組40例。磷酸肌酸鈉組患兒平均年齡(11.23±2.73)歲；男性22例，女性18例。果糖二磷酸鈉組患兒平均年齡(11.43±3.32)歲；男性27例，女性13例。磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組患兒平均年齡(10.82±4.23)歲；男性16例，女性24例。三組患兒年齡、性別等資料相似，具備可比性。

1.2 治療方法

(1)磷酸肌酸鈉組患兒使用注射用磷酸肌酸鈉[規(guī)格：0.5 g(以C4H8N3O5PNa2計)]，1日1 g，靜脈注射，分2次給藥。(2)果糖二磷酸鈉組患兒口服果糖二磷酸鈉片[規(guī)格：0.25 g(以C6H11Na3O12P2計)]，1日200 mg/kg，分2次給藥。(3)磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組患兒使用注射用磷酸肌酸鈉靜脈注射，并口服果糖二磷酸鈉片，用法與用量同磷酸肌酸鈉組、果糖二磷酸鈉組。三組患兒均連續(xù)治療3周。

1.3 觀察指標(biāo)

分別取治療前后患兒清晨空腹?fàn)顟B(tài)靜脈血，已酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明書為指導(dǎo)處理患者血液樣本，檢測cTnT、CK-MB、TNF-α和IL-6水平，以及miRNA表達水平。

1.4 細胞實驗方法

1.4.1 材料：(1)細胞。人心肌細胞(HCM，上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號為6200，品牌為Sciencell)；CVB3病毒由中國醫(yī)科院生物技術(shù)研究所提供。(2)儀器。ABI 7500型實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(北京安麥格貿(mào)易有限公司)；GIS-500型凝膠成像分析儀(杭州谷峰科學(xué)儀器有限公司)；HBS-1096A型酶標(biāo)分析儀(上海研卉生物科技有限公司)。(3)藥品與試劑。注射用磷酸肌酸鈉(北京朋來制藥有限公司，批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字H20068079)；果糖二磷酸鈉片(上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字H19991128)。miR-133b inhibitor、miR-133b mimics及pcDNA-ELAVL1由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計并合成。InvitrogenTMLipofectamineTM2000 Transfection Reagent(貨號：11668-019)購自上海偉進生物科技有限公司。TRIzol法總RNA提取試劑盒(貨號：CD-13433-ML)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：CD-102539GM)，總蛋白提取試劑盒(貨號：CD-13559-ML)，BCA蛋白法含量測試盒(貨號：CDY-2798X-SJH)，人cTnT ELISA試劑盒(貨號：CD-101420-ELISA)，人CK-MB ELISA試劑盒(貨號：CD-101354-ELISA)，人TNF-α ELISA試劑盒(貨號：CD-102490-ELA)，人IL-6 ELISA試劑盒(貨號：CD-102483-ELA)，CCK-8細胞活力檢測試劑盒(貨號：CDJ-1626C-SJH)，均購自武漢純度生物科技有限公司。anti-ELAVL1(貨號：XGK97147)，anti-GAPDH(貨號：XGK104170)，二抗(貨號：XG-X10933)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號：XG-X10548)，均購自上海西格生物科技有限公司。雙熒光素酶活性檢測試劑盒(貨號：C-8304)購自上海彩佑實業(yè)有限公司。

1.4.2 細胞培養(yǎng)、模型構(gòu)建及轉(zhuǎn)染：采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HCM，即為HCM組。待HCM出現(xiàn)搏動后以100 Tcid50作為實驗接種濃度將CVB3作用于HCM，構(gòu)建病毒性心肌炎模型細胞(CVB3-HCM)，為CVB3組。待模型構(gòu)建成功后，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-133b inhibitor、miR-133b mimics和pcDNA-ELAVL1按實驗分組需求分別轉(zhuǎn)染至CVB3-HCM，即為miR-133b inhibitor組、miR-133b mimics組和OE-ELAVL1組，另設(shè)置陰性對照組(NC組)；48 h后驗證轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功即可用于后續(xù)實驗。另外，采用磷酸肌酸鈉和果糖二磷酸鈉聯(lián)合處理上述各組細胞，根據(jù)各組轉(zhuǎn)染的載體不同，分為磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉處理無載體轉(zhuǎn)染CVB3-HCM細胞(磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組)，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉處理OE-ELAVL1組(磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+OE-ELAVL1組)、磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉處理miR-133b inhibitor組(磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+miR-133b inhibitor組)，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉處理同時轉(zhuǎn)染miR-133b mimic和pcDNA-ELAVL1的CVB3-HCM細胞(磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+miR-133b mimic+OE-ELAVL1組)。

1.4.3 CCK-8檢測細胞毒性：用不同濃度磷酸肌酸鈉或果糖二磷酸鈉處理CVB3-HCM，通過細胞存活率確定磷酸肌酸鈉和果糖二磷酸鈉的細胞毒性。采用CCK-8檢測細胞毒性，將濃度為5×103個/mL的CVB3-HCM接種于96孔板，于37 ℃、5%CO2下穩(wěn)定24 h后，加入不同濃度磷酸肌酸鈉(1、5、10、20和30 mmol/L)或果糖二磷酸鈉(1、3、5、10和20 mg/mL)處理細胞24 h，再加入CCK-8孵育后于450 nm處測吸光度。

1.4.4 實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)檢測miR-133b水平：細胞中總RNA用Trizol法RNA提取試劑盒提取后，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，而后進行擴增，條件為95 ℃、10 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，45個循環(huán)。引物序列如下，內(nèi)參U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-133b上游引物為5′-AAGAAAGATGCCCCCTGCTC-3′，下游引物為5′-GTAGCT GGTTGAAGGGGACC-3′。采用2-ΔΔCt法以U6為內(nèi)參對miR-133b的相對表達量進行計算。

1.4.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測ELAVL1的表達：細胞中的總蛋白用蛋白提取試劑盒提取后經(jīng)BCA蛋白法含量測試盒檢測濃度，然后將等量提取出的蛋白上樣后用10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h后加入1∶1 000一抗anti-ELAVL1后在4 ℃下孵育過夜。次日，去除一抗，加入1∶1 000二抗孵育1 h。孵育結(jié)束后，洗膜，加ECL發(fā)光試劑顯影。

1.4.6 ELISA檢測心肌損傷標(biāo)志物及炎癥因子水平：根據(jù)ELISA，處理人CVB3-HCM細胞，檢測細胞心肌損傷標(biāo)志物(cTnT和CK-MB)、炎癥因子(TNF-α和IL-6)水平。

1.4.7 免疫熒光檢測細胞焦亡：在室溫(25 ℃)下用4%多聚甲醛緩沖液處理各實驗組細胞20 min后加入1%的BSA和0.1%的Triton-X反應(yīng)1 h，然后在4 ℃下用NLRP3及caspase-1抗體孵育過夜。次日洗脫一抗后加二抗處理1 h，并用DAPI對細胞核進行染色。染色結(jié)束后于熒光顯微鏡下拍照。

1.4.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-133b和ELAVL1的靶向關(guān)系：根據(jù)雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書，將miR-133b和ELAVL1結(jié)合片段的序列擴增后插入熒光素酶載體中構(gòu)建野生型ELAVL1載體(ELAVL1-WT)、結(jié)合位點序列突變后插入熒光素酶載體中構(gòu)建突變型ELAVL1載體(ELAVL1-MUT)，而后將ELAVL1-WT或ELAVL1-MUT與miR-133b mimics分別轉(zhuǎn)染至293T細胞中在37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)48 h后檢測熒光素酶活性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉治療小兒心肌炎的臨床研究

與治療前相比，治療后磷酸肌酸鈉組、果糖二磷酸鈉組和磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組患兒體內(nèi)心肌損傷標(biāo)志物(cTnT、CK-MB)和炎癥因子(TNF-α、IL-6)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。治療前后患兒靜脈血樣本中異常表達的miRNA見圖1，結(jié)果顯示，miR-133b表達水平在每組治療后均顯著上調(diào)。

圖1 病毒性心肌炎患兒經(jīng)磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉治療前后miRNA表達譜

表1 三組患兒治療前后心肌損傷標(biāo)志物變化比較

2.2 磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉通過miR-133b對CVB3-HCM的影響

采用RT-qPCR檢測心肌細胞中miR-133b水平發(fā)現(xiàn)，與HCM組miR-133b水平(1.00±0.07)相比，CVB3組miR-133b水平(0.50±0.09)顯著降低，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組CVB3-HCM中miR-133b水平(0.94±0.05)顯著上調(diào)，三組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=41.66，P=0.000 3)。miR-133b inhibitor轉(zhuǎn)染至CVB3-HCM后的RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與NC組miR-133b水平(1.02±0.04)相比，miR-133b inhibitor組miR-133b水平(0.03±0.06)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.53，P=0.000 062)。檢測cTnT、CK-MB、TNF-α及IL-6水平發(fā)現(xiàn)，與CVB3組相比，心肌損傷標(biāo)志物及炎癥因子在磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組CVB3-HCM中顯著降低，但磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+miR-133b inhibitor組CVB3-HCM中與CVB3組相近，見表2。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與CVB3組相比，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組CVB3-HCM中NLRP3及caspase-1顯著被抑制，miR-133b inhibitor組的CVB3-HCM細胞焦亡標(biāo)志物水平無顯著變化，見圖2。

表2 磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉處理對心肌細胞損傷標(biāo)志物及炎癥因子水平的影響

圖2 磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉通過miR-133b對CVB3-HCM焦亡的影響

2.3 miR-133b與ELAVL1的靶向關(guān)系

ELAVL1(ELAV-like protein 1)與miR-133b的靶向結(jié)合位點見圖3(A)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與NC組相比，miR-133b mimics組ELAVL1野生型載體(ELAVL1-WT)的熒光素酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但兩組ELAVL1突變型載體(ELAVL1-MUT)的熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。在CVB3-HCM中轉(zhuǎn)染miR-133b mimics后的RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與NC組miR-133b水平(1.01±0.04)相比，miR-133b mimics組CVB3-HCM中miR-133b水平(2.28±0.22)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.86，P=0.000 6)。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-133b mimics組ELAVL1蛋白水平顯著低于NC組，見圖3(B)。

A.miR-133b和ELAVL1的結(jié)合位點；B.miR-133b對ELAVL1蛋白表達水平的影響

表3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-133b與ELAVL1的靶向關(guān)系

2.4 磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉通過miR-133b/ELAVL1分子軸對CVB3-HCM細胞損傷、炎癥反應(yīng)及細胞焦亡的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測ELAVL1蛋白水平結(jié)果顯示，與CVB3組相比，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組CVB3-HCM中ELAVL1蛋白水平顯著降低，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+OE-ELAVL1組中ELAVL1蛋白水平顯著高于磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+OE-ELAVL1+miR-133b mimics組ELAVL1蛋白水平顯著低于磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+OE-ELAVL1組，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4(A)。各組心肌損傷標(biāo)志物、炎癥因子及細胞焦亡結(jié)果顯示，磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組CVB3-HCM心肌細胞中cTnT、CK-MB、TNF-α和IL-6水平，NLRP3、caspase-1表達水平顯著低于CVB3組；磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+OE-ELAVL1組cTnT、CK-MB、TNF-α和IL-6水平，NLRP3、caspase-1表達水平顯著高于磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉組；而磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+OE-ELAVL1+miR-133b mimics組CVB3-HCM細胞損傷、炎癥因子及細胞焦亡標(biāo)志物水平均顯著低于磷酸肌酸鈉+果糖二磷酸鈉+OE-ELAVL1組，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖4(B)。

表4 磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉通過miR-133b/ELAVL1分子軸對CVB3-HCM細胞損傷及炎癥反應(yīng)的影響

3 討論

病毒性心肌炎為兒科常見的后天性心臟疾病，具有擴張型心肌病、預(yù)后差等多種不良影響[10]。在小兒病毒性心肌炎的治療中，磷酸肌酸鈉、果糖二磷酸鈉及兩者聯(lián)合應(yīng)用成為臨床上較為常見的有效治療方法[11-12]。尤其是磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉的療效得到了廣泛的認(rèn)可[13-14]。但對聯(lián)合用藥作用機制的研究缺失成為該治療方案進一步推廣中亟待解決的問題。本研究通過臨床治療肯定了磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉的療效，篩選出有可能參與藥效發(fā)揮的miRNA，并在細胞水平對此機制加以驗證。

本研究在臨床水平和細胞水平的結(jié)果均證實，miR-133b在病毒性心肌炎患兒血液樣本及CVB3感染的心肌細胞中表達顯著下調(diào)，而經(jīng)過磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉治療后miR-133b表達水平顯著上調(diào)；后續(xù)細胞水平的實驗結(jié)果也表明，敲降CVB3感染的心肌細胞中miR-133b后，磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉可逆轉(zhuǎn)CVB3所致細胞損傷、炎癥反應(yīng)及細胞焦亡的抑制作用。該結(jié)果不僅提示異常低表達的miR-133b有成為小兒病毒性心肌炎標(biāo)志物的潛在可能性，也表明磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉對小兒病毒性心肌炎的治療作用可能是通過上調(diào)miR-133b表達，進而抑制病毒對心肌細胞的損傷。有研究結(jié)果提出，過表達miR-133b可減弱病毒對心肌炎患兒心肌細胞的損傷[15]；過表達miR-133b能夠有效降低細胞中IL-1β、IL-6及TNF-α水平，緩解炎癥反應(yīng)[16]；細胞焦亡關(guān)鍵基因NLRP3是miR-133b的潛在下游靶基因[17]。上述研究也從多個角度進一步支撐了本研究結(jié)果。

miRNA通過調(diào)節(jié)下游靶基因參與細胞的生理過程已得到廣泛證實，通過StarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)ELAVL1是miR-133b的靶基因之一，進一步采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灱暗鞍踪|(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，miR-133b靶向負調(diào)控CVB3-HCM中ELAVL1蛋白。本研究中，miR-133b的靶基因ELAVL1被過表達后，磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉對CVB3感染心肌細胞的治療作用將被顯著削弱，可見，ELAVL1在磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉治療小兒病毒性心肌炎中意義重大。ELAVL1是一種廣泛表達的RNA結(jié)合蛋白，能夠作為RNA調(diào)節(jié)因子，通過多種轉(zhuǎn)錄后機制介導(dǎo)多種蛋白的表達[18]。有研究結(jié)果表明，人肺上皮細胞中ELAVL1表達被抑制后，TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-18等多種炎癥因子的釋放也隨之減少；此外，與細胞焦亡相關(guān)的NLRP3、Gasdermin D及caspase-1蛋白水平也顯著降低[19]。針對人心室肌細胞的研究結(jié)果也表明，敲除ELAVL1基因可通過抑制NLRP3、caspase-1和IL-1β，緩解高糖誘導(dǎo)的細胞焦亡[20]。以上結(jié)果與本研究一致，即過表達ELAVL1能夠促進CVB3-HCM細胞焦亡和炎癥反應(yīng)。

綜上所述，磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉通過上調(diào)病毒性心肌炎心肌細胞中miR-133b的表達，抑制ELAVL1蛋白，從而緩解CVB3對心肌細胞的損傷，抑制炎癥反應(yīng)和細胞焦亡。本研究結(jié)果可為磷酸肌酸鈉聯(lián)合果糖二磷酸鈉治療小兒病毒性心肌炎提供分子機制方面的支持。