鞘內(nèi)注射膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對大鼠糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的影響

陳藝舟，王 影，趙 丹，孫 立，劉永哲，郭文治，高明龍，

糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是一種最常見的糖尿病慢性并發(fā)癥，與血糖的代謝紊亂有關(guān)，臨床特征為誘發(fā)痛、自發(fā)痛、異常性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏等，患病率為10%～26%。迄今為止，DNP的發(fā)病機制仍未完全明確。

膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glail cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)是從大鼠膠質(zhì)細胞系B49的無血清培養(yǎng)液中分離出來的糖基化的二硫鍵結(jié)合的同源二聚體蛋白質(zhì)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員。GDNF最初被確定為中腦多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)因子，并被認(rèn)為可以用于治療帕金森病。有研究表明，GDNF不僅對多巴胺能神經(jīng)元有促活、促分化作用，還對發(fā)育和成熟的運動神經(jīng)元具有營養(yǎng)作用。近年來，GDNF對神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NP)的鎮(zhèn)痛作用受到人們的廣泛關(guān)注，隨著對GDNF鎮(zhèn)痛作用機制的不斷闡明，GDNF及其受體有望成為治療NP的新靶點。DNP屬于一種典型的NP，因此對GDNF及其受體的深入研究也有利于拓展治療DNP的新思路。

本研究利用鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)建立DNP大鼠模型，觀察大鼠行為學(xué)變化，脊髓中磷酸化PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-S6K表達變化以及鞘內(nèi)注射GDNF后對大鼠行為學(xué)變化和上述蛋白表達變化有無影響，探討鞘內(nèi)注射GDNF對DNP的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物飼養(yǎng)條件 50只健康雄性SD大鼠，體重(290±10)g，由斯貝福提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0010。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后用于實驗。

1.2 DNP模型制備 50只健康SD大鼠隨機分為兩組，模型組(=40)和對照組(N組，=10)。模型組單次腹腔注射2% STZ緩沖液55 mg/kg (STZ+檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH=4.2)；對照組單次腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液2.5 ml/kg，pH=4.2。兩組大鼠同條件下飼養(yǎng)21 d。21 d后，鼠尾靜脈血糖穩(wěn)定>16.7 mmol/L且TFT下降值>20%基線值的大鼠視為成功DNP模型，并將其歸于新模型組。

1.3 實驗分組 在新模型組中隨機抽出20只，分為DG組和DC組，每組10只。用10%水合氯醛+七氟醚對大鼠進行復(fù)合麻醉，以L間隙為穿刺點，用30 G細針頭穿刺，觀察有抬足或甩尾反應(yīng)后，DG組注射2 μg GDNF+10 μl PBS緩沖液；DC組注射10 μl PBS緩沖液；N組不作任何干預(yù)處理。給藥或PBS均為隔天一次，共7次。

1.4 血糖測定 用采血針在距尾尖0.5 cm處取鼠尾靜脈血，利用便攜式血糖儀和快速血糖試紙測定血糖濃度。血糖測定時間點為造模前、造模后第3、21 天，上午9:00-11:00，所有測定均由同一人完成。將造模后第21 天鼠尾靜脈血糖穩(wěn)定>16.7 mmol/L的大鼠視為糖尿病大鼠。

1.5 行為學(xué)測定

1.5.1 壓尾機械閾值(TFT)測定 在大鼠尾巴上距尾尖10 cm處做一標(biāo)記，保持標(biāo)記點在楔形壓痛模塊下方，待大鼠安靜后開始測量，大鼠出現(xiàn)明顯躁動或甩尾反應(yīng)時，記錄壓力值(g)，重復(fù)測量2次，每次間隔15 min，取2次平均值作為大鼠的TFT，為避免組織損傷，將實驗終點的最大值設(shè)為600 g。

1.5.2 熱痛縮爪潛伏期(PWL)測定 將熱板儀溫度設(shè)定為(52.0±0.2)℃，到達設(shè)定溫度后將大鼠左后足貼于熱板，并開始計時，當(dāng)感覺大鼠有明顯的逃避動作時，停止計時，重復(fù)測試2次，取平均值作為該大鼠的PWL，兩次測試間隔不應(yīng)小于15 min。為防止大鼠后足燙傷，最大值設(shè)置為30 s。

各組均應(yīng)測定造模前，造模后第3、21天，首次給藥或PBS后的第1、3、7、14天的TFT和PWL。其中以測定的造模前TFT和PWL為基線值。每次測定時間為上午9:00-11:00，所有測定均由同一人完成。

1.6 Western blot法測定磷酸化PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-S6K表達 將大鼠斷頭處死，在冰上取L脊髓組織，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中冷凍保存。采用Western blot法測定磷酸化PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-S6K表達，脊髓組織中加入RIPA裂解液(AR0105)和磷酸酶抑制劑(AR1183)，冰上勻漿后離心，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒(AR0146)進行蛋白濃度測定。以50 μg蛋白在SDS-PAGE膠上電泳，轉(zhuǎn)印至NC膜上。用BSA-TBS緩沖系統(tǒng)封閉液封閉2 h，加入用一抗稀釋液(AR1017)稀釋的一抗(P-mTOR抗體，1∶ 800；p-AKT抗體，1∶800；p-S6K抗體，1∶1000；PIK3CA抗體，1∶1000)，搖床上4 ℃孵育過夜，TBS-T洗膜10 min 3次，加入稀釋過的二抗(HRP-羊抗兔，1∶5000；HRP-羊抗小鼠，1∶5000)，室溫下孵育2 h，TBS-T洗膜10 min 3次，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑(AR1196)進行發(fā)光顯色，應(yīng)用成像分析儀自動成像，運用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。以β-Actin、GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠生理變化情況 造模前，模型組的體重與N組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；造模后第3、21天，模型組與N組的體重比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(<0.01)；給藥后第3、7、14 天，與N組相比較，DC組以及DG組的體重均明顯下降(<0.01)，而DG組與DC組的體重相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(>0.05，表1、2)。

2.2 大鼠血糖變化情況 造模前，N組與模型組的血糖比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義；造模后第3、21 天，模型組與N組相比較，血糖均明顯升高(<0.01，表3)。

2.3 壓尾機械閾值(TFT)及熱痛縮爪潛伏期(PWL)的變化情況 造模前，N組與模型組的TFT、PWL比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；造模后第3天，模型組的TFT和PWL值開始降低；造模后第21天，模型組的TFT和PWL值明顯降低，與N組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01，表4)。

給藥后第3 天，DG組的TFT和PWL值開始升高；給藥后第7 天，DG組的TFT和PWL值明顯升高，與DC組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)，且DC組明顯低于N組(<0.01)；給藥后第14天，DG組的TFT和PWL值與N組相比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，且DC組明顯低于N組(<0.01，表5)。

2.4 脊髓磷酸化PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-S6K表達變化情況 DC組與N組比較，DC組脊髓背角磷酸化PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-S6K均明顯升高(<0.01)；DG組與DC組相比較，DG組脊髓背角磷酸化PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-S6K均降低(<0.01)；DG組與N組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表6，圖1)。

3 討 論

GDNF是新發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，也是目前已知對受損多巴胺能神經(jīng)元以及運動神經(jīng)元作用最強的神經(jīng)營養(yǎng)因子，并且有實驗研究發(fā)現(xiàn)GDNF對NP有一定的鎮(zhèn)痛作用。GDNF發(fā)揮生物效應(yīng)依賴于與其受體的結(jié)合，即各種神經(jīng)元對GDNF產(chǎn)生應(yīng)答的前提是必須有GDNF受體存在。目前普遍認(rèn)同的GDNF作用機制為：GDNF首先與固定于細胞膜外層的GFRα-1特異性結(jié)合，引起GFRα-1二聚體化，形成復(fù)合物，該復(fù)合物與Ret的細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活Ret蛋白磷酸化，磷酸化的Ret進一步激活其存在于細胞內(nèi)的下游底物，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、PI3K等，從而發(fā)揮GDNF的生物學(xué)效應(yīng)。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種廣泛存在于各種生物細胞中的非典型絲氨酸/蘇氨酸磷酸化激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinase，PIKK)蛋白質(zhì)家族成員。其通過參與轉(zhuǎn)錄、翻譯、核糖體合成等多種生物過程，調(diào)節(jié)細胞的代謝、增殖、分化、凋亡等多種生理過程，同時mTOR也參與細胞因子、生長因子、谷氨酸等刺激誘發(fā)突觸可塑性的過程。

近年有研究發(fā)現(xiàn)，mTOR通過調(diào)控蛋白合成，參與外周敏化和中樞敏化，在維持慢性疼痛狀態(tài)中扮演重要角色。在癌痛、炎性痛、神經(jīng)病理性疼痛等多種疼痛模型的脊髓背角表層發(fā)現(xiàn)AKT信號通路處于激活狀態(tài)，且mTOR激活并大量表達，表明PI3K-AKT-mTOR信號通路廣泛參與這些疼痛模型中突觸可塑性的形成過程以及疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。AKT是PI3K下游的重要信號物質(zhì)，王存金等利用CCI大鼠模型，注射GDNF后的CCI大鼠熱痛敏程度明顯降低，體內(nèi)p-AKT表達也明顯下降。表明GDNF能通過調(diào)控PI3K-AKT信號通路，降低p-AKT表達水平，從而達到鎮(zhèn)痛的作用。mTOR是AKT的下游因子之一，有研究觀察到DNP大鼠脊髓背角中mTOR的大量激活與DNP機械痛閾過敏時間一致，通過鞘內(nèi)持續(xù)注射雷帕霉素，治療組p-S6K逐漸下降，而機械縮足閾值開始逐漸升高，實驗表明DNP慢性疼痛狀態(tài)的維持依賴于mTOR和S6K的表達和磷酸化，大鼠脊髓mTOR上調(diào)并活化可能是DNP的發(fā)病機制之一。

在現(xiàn)有的關(guān)于DNP發(fā)病機制的研究中，已經(jīng)闡明了TNF-α等炎性因子在DNP的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，而有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α等炎性因子與mTOR的激活存在一定的聯(lián)系，并且mTOR控制著轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活動。此外，還有發(fā)現(xiàn)mTOR還參與調(diào)控P38MAPK調(diào)節(jié)蛋白的合成，而P38MAPK的激活目前也被認(rèn)為在DNP發(fā)生中起重要作用。根據(jù)以往的研究我們還可以推測mTOR通過介導(dǎo)P38MAPK調(diào)節(jié)蛋白的大量合成以及上調(diào)TNF-α等炎性因子參與DNP的發(fā)生及發(fā)展過程，具體情況還需進一步實驗研究。

本研究利用由STZ誘導(dǎo)的DNP大鼠模型，探究GDNF對DNP大鼠行為學(xué)的影響，以及脊髓背角磷酸化PI3K、p-AKT、p-mTOR和p-S6K表達水平的影響。實驗結(jié)果顯示，鞘內(nèi)注射GDNF能有效緩解DNP大鼠的疼痛，并且降低磷酸化PI3K、p-AKT、p-mTOR和p-S6K的表達水平，提示GDNF發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機制可能是GDNF與GFRα-1特異性結(jié)合形成復(fù)合體，該復(fù)合體再與Ret細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活跨膜受體Ret磷酸化，進而激活細胞內(nèi)PI3K/AKT信號通路，下調(diào)p-AKT表達水平，從而抑制p-mTOR及mTOR下游底物p-S6K的表達，之后可能通過減少P38MAPK的合成以及下調(diào)TNF-α等炎性因子，最終達到緩解DNP的目的。本實驗結(jié)論可以為進一步明確GDNF的鎮(zhèn)痛作用機制提供支持，為臨床治療DNP提供新思路。