線粒體DNA D-環(huán)區(qū)單核苷酸多態(tài)性與胃癌發(fā)病年齡的關(guān)系研究

王英南，吳忱思，趙樂，張風(fēng)賓，張韶辰，郭占軍，張瑞星*

胃癌（gastric cancer）是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，死亡率居惡性腫瘤第4位，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康[1]。中國更是胃癌大國，據(jù)2020年研究數(shù)據(jù)表明，中國每年新發(fā)病例45.7萬，死亡病例30.0萬，無論發(fā)病人數(shù)還是死亡人數(shù)，均居全球第1位，防控形勢嚴(yán)峻[2]。目前研究表明，大多數(shù)國家40歲及以上人群的胃癌發(fā)病率在下降，而在40歲以下人群中胃癌發(fā)病率逐漸上升，且年輕胃癌患者具有起病隱匿、進(jìn)展迅速、淋巴轉(zhuǎn)結(jié)移早、腹膜轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差等特點，給家庭、社會造成重大影響[3-4]。因此迫切需要探索預(yù)測胃癌發(fā)病年齡的相關(guān)因素及機(jī)制，以期在特定人群中采取更多的預(yù)防策略，降低胃癌發(fā)病率。

胃癌的形成是一個多基因、多因素參與的過程，近年來發(fā)現(xiàn)胃癌的發(fā)生不僅與核基因的變化相關(guān)，還與細(xì)胞核外遺傳物質(zhì)線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的突變及單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）關(guān)系密切。人類mtDNA是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì)，由于其特殊的性質(zhì)，例如缺乏組蛋白的保護(hù)以及修復(fù)系統(tǒng)不完善，與核內(nèi)基因組相比，mtDNA更容易發(fā)生突變[5-6]。D-環(huán)區(qū)（D-Loop區(qū)）作為 mtDNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點，具有高度不穩(wěn)定性，在包括胃癌等多種惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，D-Loop區(qū)是mtDNA突變和多態(tài)性的熱點區(qū)域[7-9]。這些突變和多態(tài)性可能抑制線粒體電子傳遞鏈的傳導(dǎo)，導(dǎo)致大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）釋放，不斷刺激細(xì)胞增殖分化，最終誘發(fā)腫瘤[10]。為進(jìn)一步防控胃癌，本研究對胃癌患者外周血中的mtDNA D-Loop區(qū)進(jìn)行測序分析，分析其與胃癌患者發(fā)病年齡的關(guān)系，以期尋找預(yù)測發(fā)病年齡的指標(biāo)，從而針對特定人群進(jìn)行早期預(yù)警及干預(yù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2007年7月至2008年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院消化內(nèi)科就診并經(jīng)胃鏡病理證實的各期胃癌患者150例作為研究對象。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他部位腫瘤；病理類型為鱗癌、腺鱗癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌等其他病理類型。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（MEC2008-2），患者均對本研究知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 收集患者的臨床特征，包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、分化程度、TNM分期等。采集所有患者空腹外周靜脈血，即刻放置在-4 ℃冰箱中恒溫保存。

1.2.2 mtDNA提取、PCR擴(kuò)增及基因測序 采用美國Promega公司生產(chǎn)的全血線粒體萃取試劑盒迅速提取mtDNA后置于-80 ℃恒溫保存。經(jīng)定量鑒定合格后的DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法擴(kuò)增目的片段，上游引物為：5'-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3'，下游引物為：5'-GCTTTGAGG AGGTAAGCTAC-3'。應(yīng)用PCR預(yù)混試劑（Promega，Madison，WI，美國）、PCR儀（AS Applied Biosystems 9902，美國）進(jìn)行分析，PCR具體反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，38個循環(huán)，最后于72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后，采用ABI PRISM? BigDye Terminator v3.1循環(huán)測序反應(yīng)試劑盒進(jìn)行DNA測序。同一標(biāo)本采用雙向、測通、重復(fù)測序。

1.3 觀察指標(biāo) 分析不同臨床特征胃癌患者發(fā)病年齡，胃癌患者mtDNA D-Loop 區(qū)SNPs與發(fā)病年齡之間的關(guān)系，以及胃癌患者發(fā)病年齡影響因素。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制胃癌患者發(fā)病年齡的生存曲線，生存曲線比較采用Log-rank檢驗；胃癌患者發(fā)病年齡的影響因素分析采用多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征胃癌患者發(fā)病年齡比較 150例胃癌患者中，＜40歲6例（4.0%），40～50歲19例（12.7%），51～60歲49例（32.7%），＞60歲76例（50.6%）。不同性別、腫瘤大小、腫瘤部位、TNM分期患者發(fā)病年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；不同分化程度患者發(fā)病年齡比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同臨床特征胃癌患者發(fā)病年齡比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of age at onset in gastric cancer patients with different characteristics

2.2 胃癌患者mtDNA D-Loop 區(qū)SNPs與發(fā)病年齡之間的關(guān)系 將150例胃癌患者mtDNA D-Loop區(qū)的測序結(jié)果與人類mtDNA文庫記錄的劍橋序列進(jìn)行比對，共發(fā)現(xiàn)106個多態(tài)位點，將最小等位基因頻率＜5%的位點剔除，共得到21個SNPs位點進(jìn)一步分析，分別是位點73A/G、146T/C、150C/T、152T/C、153A/G、195T/C、199T/C、204T/C、249A/del、263A/G、309C/CC、489T/C、523-524AC/del、16261C/T、16290C/T、16298T/C、16304T/C、16311T/C、16319G/A、16362T/C、16519T/C。采用Kaplan-Meier法繪制胃癌患者發(fā)病年齡的生存曲線，采用Log-rank檢驗分析mtDNA D-Loop區(qū)SNPs與患者發(fā)病年齡之間的關(guān)系，結(jié)果顯示153A/G與患者發(fā)病年齡有關(guān)，153G基因型患者的平均發(fā)病年齡為（48.0±5.3）歲，153A基因型患者為（60.1±0.8）歲，153G基因型患者的發(fā)病年齡早于153A基因型患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.757，P=0.005），見圖1；其他位點SNPs與患者發(fā)病年齡的關(guān)系比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 mtDNA D-Loop區(qū)SNPs位點153A/G胃癌患者發(fā)病年齡的生存曲線Figure 1 Survival curves associated with the age at onset for gastric cancer patients according to the 153A/G polymorphism in mitochondrial D-Loop

2.3 胃癌患者發(fā)病年齡影響因素的多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析 以胃癌患者發(fā)病年齡（賦值：實測值）為因變量，以性別（賦值：男=0，女=1）、mtDNA D-Loop區(qū)153位點（賦值：G基因型=0，A基因型=1）為自變量進(jìn)行多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析，結(jié)果顯示，mtDNA D-Loop區(qū)SNPs位點153A/G是預(yù)測胃癌患者發(fā)病年齡的影響因素（P＜0.05），見表2。

表2 胃癌患者發(fā)病年齡影響因素的多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析Table 2 Multivariate Cox regression analysis of possible predictors associated with the age at onset of gastric cancer

3 討論

胃癌的發(fā)病率和死亡率長期居高不下，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康。雖然近幾十年來胃癌的發(fā)病率逐漸下降，但年輕胃癌患者的發(fā)病率和死亡率均在增加[11]。各項研究對年輕胃癌患者的年齡定義和納入標(biāo)準(zhǔn)不同，年輕胃癌患者常被定義為年齡＜40歲或＜45歲，以40歲為年齡界限，胃癌發(fā)病率從1973年1.7%的最低點增加至2015年的3.5%[12-14]。本研究中＜40歲的胃癌患者所占比例為4%，與上述研究一致[12]。年輕胃癌具有侵襲性強(qiáng)、擴(kuò)散快、預(yù)后不良等特點，且在病理組織分型中，以低分化腺癌、印戒細(xì)胞癌為主。HUANG等[14]篩查了3 000余例胃癌患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)年輕胃癌女性患者所占比例明顯高于男性，并與Lauren彌漫型和較低的腫瘤分化有關(guān)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)發(fā)病年齡小的患者腫瘤分化程度較低，提示發(fā)病年齡小的患者腫瘤惡性度更高，更容易給家庭、社會造成疾病負(fù)擔(dān)，因此迫切需要深入探討預(yù)測胃癌發(fā)病年齡的因素及相關(guān)機(jī)制，以期早干預(yù)、早預(yù)防，降低年輕胃癌發(fā)病率。

胃癌的發(fā)病機(jī)制目前仍不十分清楚，可能是環(huán)境和遺傳因素共同作用的結(jié)果，但有研究顯示在年輕胃癌患者致病因素中，基因發(fā)揮的作用可能比環(huán)境致癌的影響更大[15]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，在細(xì)胞的新陳代謝、自由基產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡、信號傳導(dǎo)等多種生理過程中發(fā)揮著重要作用。由于mtDNA改變，包括突變、SNPs和拷貝數(shù)變異等引起的線粒體功能障礙可導(dǎo)致癌癥、衰老和其他多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[16]。D-Loop區(qū)是mtDNA的非編碼區(qū)，其區(qū)域內(nèi)包含重鏈復(fù)制起始點及重鏈、輕鏈轉(zhuǎn)錄的啟動子，是mtDNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控中心。D-Loop區(qū)的突變可影響線粒體功能，并在各種癌癥中被廣泛發(fā)現(xiàn)[17-19]。本課題組前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mtDNA D-Loop 區(qū)的SNPs與胃癌的發(fā)病及預(yù)后相關(guān)[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)mtDNA D-Loop區(qū)的SNPs與胃癌患者的發(fā)病年齡相關(guān)，153G基因型患者的平均發(fā)病年齡為（48.0±5.3）歲，153A基因型患者為（60.1±0.8）歲，153G基因型患者較153A基因型患者發(fā)病年齡明顯偏早，進(jìn)一步多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析顯示mtDNA D-Loop區(qū)SNPs位點153A/G是預(yù)測胃癌患者發(fā)病年齡的影響因素。LEE等[22]研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA D-Loop區(qū)16311位點的多態(tài)性可作為家族性乳腺癌患者發(fā)病年齡的預(yù)測因素，16311C基因型患者較16311T基因型患者發(fā)病年齡早。KONG等[23]研究也發(fā)現(xiàn)，mtDNA D-Loop區(qū)248位點、524位點和16304位點的多態(tài)性與卵巢癌患者的發(fā)病年齡有關(guān)，248G、16304T基因型患者較248A、16304C基因型患者的發(fā)病年齡早，而524C基因型患者發(fā)病年齡晚于524C缺失的患者。上述研究結(jié)果均表明，mtDNA D-Loop區(qū)SNPs顯示出了作為新型的預(yù)測腫瘤發(fā)病年齡的指標(biāo)的潛力。同時本研究也存在一些不足，在多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析中，未納入幽門螺桿菌感染狀態(tài)、飲食、飲酒等其他影響胃癌發(fā)病年齡的因素，將在今后的研究中進(jìn)一步完善。

新近研究顯示，線粒體作為啟動和調(diào)節(jié)代謝的細(xì)胞器，其功能障礙長期以來一直被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和與年齡有關(guān)的疾病的主要因素[24-25]。由于mtDNA易受到氧的作用，其較核基因更易發(fā)生突變，在衰老和與年齡相關(guān)的疾病中mtDNA不斷出現(xiàn)點突變和缺失，隨著mtDNA突變的不斷積累，編碼線粒體內(nèi)膜中呼吸鏈的酶受到阻礙，使呼吸鏈功能下降，進(jìn)一步導(dǎo)致更多自由基的產(chǎn)生，最終誘發(fā)細(xì)胞衰老[24-25]。在細(xì)胞衰老過程中，ROS和氧化應(yīng)激產(chǎn)物不斷增加，增加的ROS一方面可作為毒性分子加劇線粒體損傷，誘導(dǎo)體細(xì)胞mtDNA突變，導(dǎo)致線粒體氧化呼吸鏈損傷，形成惡性循環(huán)；另一方面ROS還可作為第二信使參與多種信號通路，調(diào)控基因表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移等多個生物學(xué)過程[26-27]，這也是導(dǎo)致腫瘤發(fā)病率會隨著年齡的增加而增加的重要原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)的與胃癌發(fā)病年齡相關(guān)的SNPs位點153位于D-Loop高變2區(qū)（HV2，63-322np），此區(qū)域的突變可能直接影響著mtDNA的復(fù)制并引起氧化呼吸鏈的改變，導(dǎo)致高水平的ROS釋放，大量的ROS刺激細(xì)胞不斷增殖分化，并誘發(fā)原癌基因成為癌基因，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。此外，此區(qū)域的突變可能引發(fā)線粒體呼吸能力的下降，從而引發(fā)細(xì)胞衰老，這也在一定程度上解釋了為什么mtDNA D-Loop區(qū)的SNPs會與胃癌患者發(fā)病年齡相關(guān)，但153位點多態(tài)性的具體功能尚不十分清楚，仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述，mtDNA D-Loop區(qū)SNPs位點153A/G可能作為胃癌發(fā)病年齡的新型預(yù)測指標(biāo)，這有助于識別早期發(fā)病的胃癌患者，以便早期給予干預(yù)及預(yù)防，降低胃癌發(fā)病率。

作者貢獻(xiàn)：王英南提出研究選題方向，進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、采集、清洗和統(tǒng)計學(xué)分析；王英南、吳忱思、趙樂、張風(fēng)賓負(fù)責(zé)撰寫論文初稿；吳忱思、趙樂、張風(fēng)賓、張韶辰負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、采集、清洗和統(tǒng)計學(xué)分析、繪制圖表，論文修訂；郭占軍、張瑞星進(jìn)行數(shù)據(jù)復(fù)核，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)；所有作者確認(rèn)了論文的最終稿。

本文無利益沖突。