羅伊乳桿菌對(duì)腸屏障功能調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展

岑秋宇，龐日朝，胡曉敏，崔艷如，張安仁

腸道具有與外界環(huán)境接觸面積大的特點(diǎn)，因此腸屏障在保護(hù)生物體免受病原體和外部有害物質(zhì)侵害方面起著重要作用[1]。腸屏障由相互關(guān)聯(lián)的4部分組成，分別是機(jī)械屏障（單層半透性上皮細(xì)胞）、化學(xué)屏障（黏蛋白和抗菌肽組成的黏液層）、免疫屏障（固有層中的免疫細(xì)胞和腸道淋巴組織）和微生物屏障（腸腔中的共生菌）。腸屏障功能障礙與多種疾病相互關(guān)聯(lián)，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝性疾病、消化系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等[2-5]。因此，了解導(dǎo)致腸屏障功能改變和調(diào)節(jié)的分子機(jī)制將對(duì)相關(guān)疾病的治療和預(yù)防起積極作用。

羅伊乳桿菌（Lactobacillus reuteri，L.reuteri）是腸道共生菌群的重要成員，Gerhard Reuter和Tomonari Mitsuoka 在20世紀(jì)60年代和20世紀(jì)70年代深入研究了人類消化道中的乳桿菌微生物群，并報(bào)告L.reuteri是人類胃腸道中的優(yōu)勢乳酸桿菌之一，并且經(jīng)常在糞便樣本中被檢測到[6]。此外，L.reuteri還是一種對(duì)宿主健康有多種益處的益生菌，其可定殖于腸道，減少微生物從腸腔到腸外組織的轉(zhuǎn)移，加強(qiáng)腸道物理屏障，也可通過產(chǎn)生抗菌分子，抑制病原微生物的定植，還可通過重塑宿主腸道中的微生物群組成減少促炎因子的產(chǎn)生、促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育，進(jìn)而保護(hù)宿主的腸道免疫系統(tǒng)[7]。本文針對(duì)L.reuteri的生物學(xué)特性、L.reuteri對(duì)腸屏障功能的影響及可能機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 L.reuteri的生物學(xué)特性

L.reuteri是乳酸桿菌屬的革蘭陽性兼性厭氧菌，最早于1962年被分離出來[8]，其是一種末端呈圓形的略微不規(guī)則的彎曲桿菌[9]。L.reuteri廣泛存在于人類和脊椎動(dòng)物的胃腸道，其在腸道中具有很強(qiáng)的黏附性，常定殖于近端消化道的腸上皮細(xì)胞之上。由于腸上皮細(xì)胞是腸屏障的主要構(gòu)成[10]，也就意味著腸屏障比其他組織更容易直接接觸到L.reuteri。L.reuteri主要代謝產(chǎn)物有羅伊菌素、乳酸、醋酸、乙醇和羅伊環(huán)素等抗菌物質(zhì)[9]，且前期研究已證實(shí)L.reuteri還可通過增加腸道中丁酸的含量[11]和促進(jìn)色氨酸代謝物的產(chǎn)生[12]，在宿主腸道中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用[13-14]。因此，了解L.reuteri對(duì)腸屏障功能的調(diào)控作用對(duì)腸屏障功能障礙相關(guān)疾病的治療和預(yù)防意義重大。

2 L.reuteri對(duì)腸屏障的調(diào)節(jié)作用

2.1 L.reuteri對(duì)腸機(jī)械屏障的調(diào)節(jié)作用 腸機(jī)械屏障主要由腸上皮細(xì)胞覆蓋組成，細(xì)胞間通過黏附連接（adherens junctions，AJ）和緊密連接（tight junction，TJ）相連，被認(rèn)為是腸道旁細(xì)胞通透性最重要的決定因素[15]。L.reuteri對(duì)腸機(jī)械屏障的調(diào)節(jié)作用可通過直接影響和間接影響實(shí)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，L.reuteri胞外存在大量脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）、黏液結(jié)合蛋白（mucus-binding protein，Mub）等黏附素。這些特異結(jié)構(gòu)使得L.reuteri可黏附于回腸的黏液以及上皮細(xì)胞之上，并且定殖到宿主胃腸道后形成生物膜，直接加固腸屏障，有效減少共生菌的腸外轉(zhuǎn)移。除此之外，L.reuteri還可通過刺激促腸上皮細(xì)胞以及TJ蛋白相關(guān)生長因子的表達(dá)，間接調(diào)控腸機(jī)械屏障。WU等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)在健康成年人組織中的功能是維持干細(xì)胞壁龕，并在小腸隱窩底部表達(dá)最高。利用每孔108CFU的L.reuteri D8處理由脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠腸上皮細(xì)胞損傷模型48 h后，發(fā)現(xiàn)小腸隱窩底部Lgr5+細(xì)胞（腸干細(xì)胞標(biāo)志物）數(shù)量增加，其機(jī)制可能為L.reuteri可通過促進(jìn)R-spondins基因的表達(dá)，激活并提高Wnt/β-catenin信號(hào)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，促進(jìn)腸干細(xì)胞增殖分化為腸上皮細(xì)胞，從而修復(fù)腸機(jī)械屏障功能。HOU等[17]研究發(fā)現(xiàn)使用109CFU/d的L.reuteri持續(xù)喂養(yǎng)27 d，可修復(fù)由右旋糖酐硫酸鹽（ameliorates dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的小鼠腸上皮細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能為L.reuteri可將膳食營養(yǎng)攝入的色氨酸通過吲哚-丙酮酸途徑代謝為具有芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）配體活性的吲哚-3-醛（indole-3-aldehyde，IAld），從而激活A(yù)hR信號(hào)，促進(jìn)白介素（interleukin，IL）-22表達(dá)，誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）蛋白磷酸化以加速腸上皮的增殖。既往研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路的激活與TJ蛋白的表達(dá)增強(qiáng)高度相關(guān)[18]。應(yīng)用黃芪甲苷Ⅳ干預(yù)傳輸型小鼠便秘模型5 d后觀察到小鼠的結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間以及腸道中L.reuteri的α與β多樣性，并通過菌群調(diào)控的方式在結(jié)腸中產(chǎn)生短鏈脂肪酸（丁酸），后者可以為結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)提供動(dòng)力并通過激活A(yù)kt信號(hào)通路增加TJ蛋白（claudin-1和occludin）mRNA的表達(dá)來增強(qiáng)腸機(jī)械屏障功能[19]。

綜上所述，L.reuteri一方面可通過直接黏附于腸上皮細(xì)胞來降低細(xì)胞旁通透性，減少腸道菌群的移位；另一方面可通過刺激腸上皮細(xì)胞以及TJ蛋白的增殖改善腸機(jī)械屏障功能。

2.2 L.reuteri對(duì)腸化學(xué)屏障的調(diào)節(jié)作用 腸化學(xué)屏障由消化液中的抑菌物質(zhì)、杯狀細(xì)胞分泌的黏液以及Paneth細(xì)胞分泌的抗菌相關(guān)蛋白（例如黏蛋白和抗菌肽）組成[20-21]，屏障中的抑菌物質(zhì)和抗菌相關(guān)蛋白可在特定部位發(fā)揮抑菌效能，保護(hù)腸道免受病原菌感染；該屏障的黏液層對(duì)于限制上皮細(xì)胞與腸腔內(nèi)的細(xì)菌直接接觸至關(guān)重要。研究表明，L.reuteri可通過促進(jìn)抗菌物質(zhì)產(chǎn)生以及黏蛋白的表達(dá)，加強(qiáng)腸免疫屏障的防御功能。XIE等[22]研究發(fā)現(xiàn)給予3日齡仔雞連續(xù)口服7 d 109CFU/d的L.reuteri 22后，結(jié)果顯示Notch信號(hào)通路被顯著抑制，故誘導(dǎo)了腸道干細(xì)胞分化為具有增加黏蛋白2（mucin 2，Muc-2）表達(dá)特性的杯狀細(xì)胞，另外還顯著上調(diào)了溶菌酶1（lysozyme 1，Lyz1）的mRNA表達(dá)。另有研究也發(fā)現(xiàn)，給予3日齡新生仔豬口服5 d 109CFU/d L.reuteri后，可促進(jìn)仔豬空腸中的腸道干細(xì)胞分化為杯狀細(xì)胞與Paneth細(xì)胞，這些細(xì)胞的增殖顯著上調(diào)了腸道黏液中Muc-2、Lyz1、β-防御素1以及抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs） mRNA的表達(dá)[13]，從而增強(qiáng)了腸化學(xué)屏障功能。此外，田志梅等[23]研究結(jié)果顯示，給予21日齡斷奶仔豬口服添加109CFU/kg的L.reuteri飼料后，其胃蛋白酶表達(dá)上調(diào)，該機(jī)制可能為乳桿菌通過降低胃腸pH值而促進(jìn)了蛋白酶等消化酶的產(chǎn)生，且酸性環(huán)境和消化酶的產(chǎn)生在一定程度上可抑制或殺滅病原體，保護(hù)腸屏障不被病原體攻擊，保護(hù)腸化學(xué)屏障。

綜上所述，L.reuteri可以通過促進(jìn)抗菌物質(zhì)產(chǎn)生以及降低胃腸pH值抑制病原微生物的生長。

2.3 L.reuteri對(duì)腸微生物屏障的影響 微生物群在哺乳動(dòng)物的腸道中定殖，形成了腸微生物屏障，這種微生物生態(tài)系統(tǒng)對(duì)維持腸道健康起著重要作用[24]。XIE等[25]研究結(jié)果顯示，使用109CFU/d的L.reuteri干預(yù)大腸埃希菌誘導(dǎo)的腹瀉仔豬21 d后，在門水平上，腸道益生菌如厚壁菌的比例增加，且有害菌如擬桿菌、變形菌和梭桿菌的比例降低；在屬水平上，益生菌如乳酸桿菌的相對(duì)比例有所提高，而致病菌如埃希菌、志賀菌、梭桿菌和普雷沃菌等的相對(duì)比例有所降低。值得一提的是，厚壁菌已被證實(shí)是產(chǎn)丁酸的主要菌群，可通過拮抗核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)抑制腸道炎癥。另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，使用109CFU/d的L.reuteri I5007喂養(yǎng)葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠14 d后，小鼠腸道中致病菌埃希菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬的豐度降低，結(jié)腸屏障的滲漏、黏膜潰瘍、上皮水腫和炎癥細(xì)胞浸潤有效減輕[14]。此外，HE等[26]利用 108CFU/d的 L.reuteri DSM17938干預(yù)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型小鼠20 d后，小鼠腸道中微生物群的β多樣性增加，且有益菌群如雙歧桿菌、普雷沃菌和乳桿菌的相對(duì)豐度得到有效改善，平衡了腸道菌群。

綜上所述，L.reuteri可顯著改變腸道微生物群的組成和豐度，促進(jìn)有益菌群的增殖，減少有害菌群的增殖，進(jìn)而使腸微生物屏障得到改善。

2.4 L.reuteri對(duì)腸免疫屏障的調(diào)節(jié)作用 腸免疫屏障主要包括腸黏膜固有層中的免疫細(xì)胞（如樹突細(xì)胞、駐留巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞）和腸道相關(guān)淋巴組織。腸道免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）、IL等因子[27]。L.reuteri能通過刺激相關(guān)淋巴組織促進(jìn)免疫細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并通過微生物代謝途徑促進(jìn)腸道中AhR配體和丁酸鹽的產(chǎn)生，影響AhR、NF-κB的信號(hào)傳導(dǎo)而調(diào)節(jié)炎性因子，加強(qiáng)腸免疫屏障。研究發(fā)現(xiàn)，L.reuteri通過調(diào)節(jié)大鼠回腸集合淋巴結(jié)（peyer's patch）中樹突細(xì)胞的功能，刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生sIgA，此外，其還通過調(diào)節(jié)腸道微生物群和乳桿菌的多樣性，預(yù)防腸道炎癥[28-29]。WANG等[13]研究發(fā)現(xiàn)，使用L.reuteriD8飼喂日齡仔豬5d后，仔豬空腸中CD3+T細(xì)胞數(shù)量和血清中IgG抗體、IL-4水平顯著上升，促進(jìn)了Th1輔助細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素（IFN-γ），而這些物質(zhì)可調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)，抵御病毒和細(xì)菌感染發(fā)生。WANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，使用109CFU/d的L.reuteri I5007喂養(yǎng)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠14 d后，產(chǎn)丁酸鹽菌豐度增加，進(jìn)而促進(jìn)丁酸鹽的產(chǎn)生。丁酸鹽可結(jié)合并激活過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs），拮抗NF-κB信號(hào)通路，從而在腸道中產(chǎn)生抗炎作用，具體表現(xiàn)為可降低促炎細(xì)胞因子干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-1β、IL-6、IL-8的mRNA表達(dá)情況，上調(diào)IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）的表達(dá)情況[30-31]。此外SINGH等[32]研究發(fā)現(xiàn)，L.reuteri可通過促進(jìn)丁酸鹽的產(chǎn)生刺激其下游靶基因G蛋白偶聯(lián)受體109A（G protein coupled receptor 109a，GPR109A）的表達(dá)，而丁酸可作為其配體直接激活該受體從而抑制NF-κB信號(hào)通路的磷酸化，促進(jìn)結(jié)腸巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的抗炎作用，并使二者能夠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化和結(jié)腸上皮中IL-18、IL-10的表達(dá)，并通過促進(jìn)這些抗炎基因和免疫細(xì)胞的表達(dá)加強(qiáng)腸免疫屏障。CERVANTES-BARRAGAN等[33]在體外研究中發(fā)現(xiàn)，L.reuteri釋放的羅伊素和組胺可以將腸道中的色氨酸代謝為吲哚衍生物如IAld、吲哚-3-乳酸（indole-3-lactic acid，ILA）等，這些物質(zhì)可充當(dāng)AhR配體激活A(yù)hR信號(hào)通路，將腸固有層內(nèi)的CD4+T細(xì)胞重新編程為免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞，改善炎癥性腸病小鼠的腸屏障功能障礙。另一體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將10 μg的L.reuteri CO21裂解液預(yù)處理4 h后可減輕由LPS誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞炎癥，其機(jī)制可能為L.reuteri CO21通過抑制Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路，并抑制其下游炎性因子如IL-1β、IL-12、IL-6和TNF-α的表達(dá)，上調(diào)IL-10的表達(dá)，以減輕由LPS誘導(dǎo)的IPEC-J2 細(xì)胞炎癥[25]。

綜上所述，L.reuteri可以促進(jìn)免疫細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并通過調(diào)控腸道菌群代謝產(chǎn)物激活A(yù)hR、NF-κB等信號(hào)通路，刺激其下游抗炎相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)腸免疫功能。

以上研究表明，L.reuteri在改善受損腸屏障功能方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢和巨大的潛力，其機(jī)制可能為：首先，L.reuteri通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)腸干細(xì)胞增殖分化為腸上皮細(xì)胞，并通過激活A(yù)kt信號(hào)通路促進(jìn)TJ蛋白的產(chǎn)生，修復(fù)機(jī)械屏障；其次，通過抑制Notch信號(hào)通路以誘導(dǎo)腸道干細(xì)胞分化為杯狀細(xì)胞與Paneth細(xì)胞，促進(jìn)Muc-2、Lyz1、β-防御素1以及AMPs等抗菌物質(zhì)的表達(dá)，保護(hù)化學(xué)屏障；再次，通過促進(jìn)sIgA的產(chǎn)生以及將腸道中的色氨酸轉(zhuǎn)化為AhR配體激動(dòng)劑，激活A(yù)hR信號(hào)通路將CD4+T細(xì)胞重新編程為免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞，增強(qiáng)腸道免疫力；最后，通過平衡腸道菌群促進(jìn)丁酸鹽的產(chǎn)生和GPR109A的激活，抑制TLR4、PPARs的激活，拮抗NF-κB信號(hào)通路，從而抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、IFN-γ的表達(dá)，上調(diào)抑炎細(xì)胞因子IL-10、IL-18、TGF-β的表達(dá)，改善腸道炎癥，加固免疫屏障與微生物屏障（圖1）。

圖1 L.reuteri對(duì)腸屏障作用機(jī)制圖Figure 1 The mechanism of action of Lactobacillus reuteri on intestinal barrier

3 小結(jié)

綜上所述，L.reuteri可通過修復(fù)腸道完整性、恢復(fù)黏膜層厚度、重建細(xì)菌穩(wěn)態(tài)和平衡炎性因子等途徑來調(diào)節(jié)受損的腸屏障。希波克拉底曾言：“所有疾病都起源于腸道”。近年來，腸道菌群及腸屏障領(lǐng)域越來越受關(guān)注，且大量研究提示從微生物角度出發(fā)可能是治療各種腸道疾病的重要途徑[34-36]。L.reuteri作為哺乳動(dòng)物和脊椎動(dòng)物腸道中最常見的乳酸菌已被證實(shí)在動(dòng)物體內(nèi)可參與多種代謝途徑，并通過這些代謝途徑調(diào)控腸屏障功能，從而保證機(jī)體健康。盡管在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得出L.reuteri具有較高的理論研究意義和應(yīng)用價(jià)值，但其在臨床中的應(yīng)用范圍還很局限，多集中于便秘、腹瀉、嬰兒腸絞痛、幽門螺桿菌感染、牙周炎等疾病，且L.reuteri在實(shí)際應(yīng)用中的最佳菌株、干預(yù)劑量、干預(yù)時(shí)間、用法（單用或聯(lián)合其他菌種）等還尚不十分明確。因此，未來還需要設(shè)計(jì)大量多中心、大樣本的臨床研究以明確L.reuteri對(duì)人體腸屏障功能障礙相關(guān)疾病的影響與作用。此外，要進(jìn)一步探索L.reuteri改善腸屏障功能的調(diào)控途徑和關(guān)鍵靶點(diǎn)，為腸屏障功能障礙相關(guān)疾病的預(yù)防、早期干預(yù)和治療提供新思路。

作者貢獻(xiàn)：岑秋宇提出研究選題方向，進(jìn)行論文的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、文獻(xiàn)及資料的整理，并撰寫論文初稿；崔艷如負(fù)責(zé)檢索和匯總文獻(xiàn)及資料；胡曉敏對(duì)初稿進(jìn)行修訂；龐日朝、張安仁負(fù)責(zé)論文的質(zhì)量控制及審校，對(duì)論文整體負(fù)責(zé)；所有作者確認(rèn)了論文的最終稿。

本文無利益沖突。

本文文獻(xiàn)檢索策略：

以“Lactobacillus reuteri，Intestinal barrier，Intestinal epithelial barrier，intestinal mucosal barrier，Intestinal immune barrier，gut microbiota” 為 英 文 關(guān) 鍵 詞 檢 索 PubMed、Medline、Web of Science、SCI-hub；以“羅伊乳桿菌、腸道屏障、腸道機(jī)械屏障、腸道化學(xué)屏障、腸道黏膜屏障、腸道免疫屏障、腸道菌群”為中文關(guān)鍵詞檢索中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識(shí)服務(wù)平臺(tái)、維普網(wǎng)及中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)服務(wù)系統(tǒng)。檢索時(shí)間為建庫至2021-08-20。納入標(biāo)準(zhǔn)：已發(fā)表的文獻(xiàn)；排除標(biāo)準(zhǔn)：數(shù)據(jù)信息少、重復(fù)發(fā)表、無法獲得全文或質(zhì)量差的文獻(xiàn)。