相關環(huán)狀RNA與漢族2型糖尿病發(fā)生風險的關系研究

康潔紅，常向云，朱余蓉，巴濤，孫媛

糖尿病（DM）是一組由于胰島素分泌絕對或相對不足，或外周組織對胰島素不敏感而引起的以高血糖為特征的代謝性疾病。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）公布數(shù)據(jù)，每年有超過1億人被診斷為DM，目前全世界有4.63億成年DM患者，按照增長趨勢到2045年全球將有7億DM患者[1-2]。2型糖尿?。═2DM）患者易出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥，給個人、家庭、社會帶來巨大負擔。LI等[3]于2015—2017年進行的全國第6次DM流行病學調查表明，不同民族之間DM患病率存在較大差異，其中漢族DM患病率最高（12.8%），回族最低（6.3%）。喬曉玲等[4]綜述了表觀遺傳學可通過抑制胞吐過程對T2DM第一時相胰島素分泌產生影響，中國T2DM患者存在遺傳易感性，基因組攜帶的遺傳信息分為兩類：遺傳編碼信息和表觀遺傳信息[5]。表觀遺傳學是指基于非DNA序列改變所致的基因表達水平變化，如染色質重塑、組蛋白修飾、DNA甲基化、X染色體失活、非編碼 RNA（noncoding RNA，ncRNA）調控等[6]；ncRNA調控是表觀遺傳學的重要組成部分，主要包括microRNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA和環(huán)狀RNA（circular RNAs，circRNAs）等[7]。circRNAs是新近確認的一類特殊的非編碼RNA分子，其在表達模式上具有組織特異性及細胞特異性，生物發(fā)生受特定順式作用元件及反式作用因子的調節(jié)。circRNAs具有高度穩(wěn)定性、特異性和敏感性等特點，且便于檢測，使其可成為糖尿病診斷和預測的潛在生物學標志物[8]。一些circRNAs還具有豐富性和進化保守性，以及較高的抗外切酶或核糖核酸酶降解的能力[9]。MEMCZAK等[10]報道表明，circRNAs與T2DM的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，本研究通過從新疆維吾爾族T2DM[11]患者中篩選出的差異表達明顯的4個候選circRNAs（hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922）在漢族T2DM患者中進行觀察，探討4個候選circRNAs在漢族T2DM患者中表達水平的變化及其作為生物標志物的潛在價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年9月至2021年6月在石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院內分泌代謝科及健康體檢中心就診或體檢的漢族T2DM患者（T2DM組）及漢族健康者（健康對照組）。納入標準：（1）長期居住在新疆，三代內未與其他民族通婚；（2）未合并冠心病、心肌病、惡性腫瘤、肝臟、腎臟疾病，以及急、慢性感染性疾病，未服用激素類、精神藥物或類固醇類藥物；（3）T2DM診斷符合1999年世界衛(wèi)生組織制定的糖尿病診斷標準[12]，未使用胰島素進行降糖治療；（4）T2DM組與健康對照組性別、年齡相匹配。最終納入T2DM組21例，其中男12例、女9例，年齡43～63歲，平均年齡（53.9±5.0）歲；健康對照組22例，其中男11例、女11例，年齡44～63歲，平均年齡（54.9±6.1）歲。本研究征得所有研究對象的知情同意，患者均簽署知情同意書；經石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院科技倫理委員會批準，倫理審批編號KJ2020-134-01。

1.2 研究方法 收集研究對象一般資料，包括性別、年齡，測定身高、體質量、血壓，抽取研究對象清晨空腹外周靜脈血常規(guī)送檢于石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，使用DT4-1B-24孔醫(yī)用水平離心機以4 000 r/min離心10 min，離心半徑15.6 cm，吸取離心管內上清液12 μl，根據(jù)BECKMAN COULTER AU5800系列全自動生化分析儀使用說明書測定空腹血糖（FPG）、果糖胺（FA）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）；采用羅氏COBAS 8000型電化學免疫分析儀測定空腹胰島素（FINS）、空腹C肽（CpS）。計算胰島素穩(wěn)態(tài)模型指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。另外抽取外周靜脈血5 ml，EDTA抗凝，于4 h內提取單核細胞，取EDTA管內1 ml外周靜脈血加3 ml紅細胞裂解液（1∶3）置于離心管內充分混勻，室溫靜置10 min，以4 000 r/min離心5 min，離心半徑為12.3 cm，管底可見大量白色細胞沉淀，棄去上清液，再次加入1～3 ml紅細胞裂解液混勻，以4 000 r/min離心3 min，離心半徑12.3 cm，棄去上清液，管底白色沉淀物按照TRIZOL試劑盒（美國Invitrogen公司）說明書，提取血單核細胞的總RNA。

采用RT-PCR方法檢測各組樣本中候選circRNAs（hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922）水平，反應體系為40個循環(huán)，先95 ℃變性1 s，再把溫度降到60 ℃、31 s進行延伸反應，以管家基因ACTB（β-actin）作為內參照，每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環(huán)數(shù)為CT值，circRNAs相對表達水平用2-ΔΔCT表示，所有樣本重復3次，取平均值，2-ΔΔCT越高，circRNAs表達水平越高。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數(shù)資料的分析采用χ2檢驗；采用多元線性回歸分析探究circRNAs與T2DM臨床生化指標的關系；采用Logistic回歸模型估計circRNAs的2-ΔΔCT變化時漢族T2DM患病風險的改變量，同時繪制受試者工作特征（ROC）曲線，通過ROC曲線下面積（AUC）判斷候選circRNAs對T2DM的診斷價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組一般資料、生化指標及候選circRNAs相對表達水平比較 健康對照組和T2DM組性別、年齡、體質指數(shù)（BMI）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、FINS、CpS、HOMA-IR、LDL-C、HDL-C比 較， 差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；T2DM組FPG、FA及hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922相對表達水平均高于健康對照組，hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634均低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組一般資料、生化指標及4個候選circRNAs相對表達水平比較Table 1 Comparison of general information，biochemical indicators and relative expression levels of four candidate circRNAs in T2DM Han Chinese and healthy Han Chinese

2.2 多元線性回歸分析探究circRNAs與糖代謝相關指標的關系 以4個候選circRNAs的相對表達量為因變量，對所有入組人群使用前進法逐步引入糖代謝相關指標FPG、FA、Log2FINS、CpS為自變量進行多元線性回歸分析，結果顯示，hsa_circ_0005414 2-ΔΔCT=1.835-0.171×FPG，R2=0.290；hsa_circ_0139634 2-ΔΔCT=1.878-0.438×FA，R2=0.159；hsa_circ_0032491 2-ΔΔCT=3.808+0.876×FPG-1.023×Log2FINS，R2=0.503；hsa_circ_0002922 2-ΔΔCT=0.170+0.281×FPG，R2=0.168，見表2。

表2 多元線性回歸分析探究circRNAs與糖代謝相關指標的關系Table 2 Multiple linear regression analysis of the association of four candidate circRNAs with glucose metabolism related indicators in Han Chinese

2.3 候選circRNAs診斷T2DM的ROC曲線分析繪制候選circRNAs診斷T2DM的ROC曲線，結果顯示，hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922診斷T2DM的AUC分別為0、0.199、0.968、0.844，見表3、圖1。

表3 候選circRNAs診斷T2DM的價值分析Table 3 Analysis of the value of four candidate circRNAs for the diagnosis of T2DM in Han Chinese

圖1 候選circRNAs診斷T2DM的ROC曲線Figure 1 ROC curve analysis of four candidate circRNAs in predicting T2DM in Han Chinese

2.4 候選circRNAs相對表達水平與漢族T2DM關聯(lián)性的Logistic回歸分析 以是否患有T2DM為因變量（賦值：是=1，否=0），以hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922 相對表達量為自變量，行單因素Logistic回歸分析，結果顯示，hsa_circ_0139634相對表達水平升高可降低T2DM的患病風險（P＜0.05），hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922相對表達水平升高可增加T2DM的患病風險（P＜0.05），見表4。對單因素Logistic回歸分析存在影響的基因進行多因素Logistic回歸分析顯示模型建立無法成立。

表4 候選circRNAs相對表達水平與漢族T2DM關聯(lián)性的單因素Logistic回歸分析Table 4 Univariate Logistic regression analysis of the association of three candidate circRNAs with T2DM in Han Chinese

3 討論

circRNAs被認為是一類特殊的非編碼RNA，沒有5′端帽和3′端尾，是由mRNA反向剪接產生的共價閉合RNA分子，富含miRNA結合位點，具有miRNA海綿作用，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達水平，這一機制被稱為競爭性內源性RNA（ceRNA）機制[10，13]。有研究表明 circRNAs可直接影響其宿主基因啟動子區(qū)域的表觀遺傳狀態(tài)，如乳腺癌細胞中的癌基因FLI1不僅可通過典型的癌蛋白途徑轉移，還通過其外顯子介導的表觀遺傳機制驅動腫瘤轉移[14]。YANG等[15]在T2DM中構建lncRNA-circRNAs-miRNA-mRNA網(wǎng)絡機制表明單個lncRNA和circRNAs可與多個miRNA相關，然后共同調控更多的mRNA，且lncRNA和circRNAs在T2DM中起中心調控作用。

雖然近年來大量的circRNAs被發(fā)現(xiàn)和研究，且很多研究均表明circRNAs與T2DM的發(fā)生、發(fā)展密切相關，如ZHAO等[16]通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)T2DM患者和正常對照者外周血circRNAs存在差異表達譜，并通過大樣本驗證了hsa_circ_0054633的靈敏度及特異度；王思思等[17]通過生物信息學技術篩選了與胰島素信號通路相關的3個circRNAs，研究發(fā)現(xiàn)在T2DM患者血清中has_circ_0056891、has_circ_0063425、has_circ_0071336表達水平降低，調整多個因素后再次進行統(tǒng)計學分析，結 果 提 示 has_circ_0056891、has_circ_0063425、has_circ_0071336在T2DM中表達水平降低，是T2DM的獨立預測因子，可能在T2DM及空腹血糖受損（IFG）的發(fā)病機制中起重要作用。徐文超等[18]研究發(fā)現(xiàn)在T2DM患者外周血中hsa_circ_401724表達顯著上調，并通過分析得出其可能通過靶miRNAs調控相關信號通路參與T2DM的發(fā)生、發(fā)展。LIMOGE等[19]研究表明存在VPS13B基因缺陷的細胞，其脂肪細胞分化會加速，導致脂肪蓄積增加，胰島素反應提示存在異常。寧利俐等[20]探討了我國成年隱匿性免疫性糖尿?。↙ADA）患者外周血circRNAs表達譜，研究結果表明hsa_circ_100670302、hsa_circ_0035809在LADA患者與健康者中存在明顯的表達差異，hsa_circ_100670302的基因VPS13B與胰島素抵抗（IR）相關，與健康者比較，LADA患者hsa_circ_100670302表達上調，推測hsa_circ_100670302可能通過調控VPS13B基因影響糖尿病的發(fā)生、發(fā)展，hsa_circ_0035809在T2DM、LADA患者中明顯下調。綜上所述，hsa_circ_100670302、hsa_circ_0035809可能成為區(qū)分LADA和健康個體的新型生物學標志物。同時也有研究表明circRNAs與糖尿病型心肌病、血管內皮功能障礙、糖尿病足、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病合并抑郁癥均密切相關[21-26]。

circRNAs在T2DM中的具體作用機制仍不十分明確，查閱近幾年國內外相關文獻，關于hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922與漢族T2DM之間關聯(lián)未見報道，本研究選取 hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922在漢族T2DM中進行觀察，結果表明hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634、hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922在漢族 T2DM組和健康對照組中表達水平存在明顯差異，hsa_circ_0005414、hsa_circ_0139634在漢族T2DM組中表達水平下降，將其對漢族T2DM進行診斷價值分析，發(fā)現(xiàn)上述2個候選基因對漢族T2DM無明顯診斷價值，但通過單因素Logistic回歸分析可知hsa_circ_0139634相對表達水平升高可降低T2DM的患病風險，可以推測hsa_circ_0139634雖對漢族T2DM無診斷價值但卻是漢族T2DM的獨立預測因子，通過其基因表達水平的變化可以預測漢族T2DM的患病風險，從而做到提早預防，進行生活方式干預，提高漢族T2DM的早期診斷率；而hsa_circ_0005414對漢族T2DM既無診斷價值，與其患病風險也無相關性，但卻在漢族T2DM患者中表達水平低下，有待學者進一步研究；hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922在漢族T2DM患者中表達水平明顯上調，以hsa_circ_0032491最為顯著，將表達上調基因對漢族T2DM的診斷價值進行分析，根據(jù)AUC提示其可作為早期診斷漢族T2DM較好的生物學標志物，同時進行單因素Logistic回歸分析可知其相對表達水平升高可增加漢族T2DM 的患病風險，同樣可作為預測因子，且hsa_circ_0032491可根據(jù)臨床檢測FPG、FINS水平初步評估其基因相對表達水平，從而對漢族中有潛在患T2DM的人群進行早期患病風險評估，提早進行生活方式干預，可在一定程度上減緩T2DM的進展。而hsa_circ_0032491、hsa_circ_0002922與miRNA之間是否存在關聯(lián)及其在漢族T2DM中的作用機制如何將會是后續(xù)研究的主要方向。

本研究也存在不足，選取的漢族T2DM患者未區(qū)分是否為首次診斷，也缺乏對糖耐量異常人群進行研究，同時入選例數(shù)過少，后續(xù)可進一步擴大樣本量觀察；在研究結果中T2DM組與健康對照組的FINS、CpS均無統(tǒng)計學差異，考慮是由于選取T2DM組研究對象時患者尚未使用胰島素降糖治療，研究對象只單純存在胰島素調控葡萄糖代謝能力的下降，尚未進展到胰島β細胞功能缺陷所導致的胰島素分泌減少。此外，本研究是單中心的橫斷面研究，研究對象的地理位置比較集中，其他地區(qū)的人口是否也有類似的基因表達譜，目前尚不十分清楚，隨著病程的延長基因表達水平是否存在差異也不十分明確。因此，本研究結果需要在更大樣本、更多樣化的人群中行進一步觀察和隨訪。相信闡明circRNAs在漢族T2DM中的具體作用機制會將DM的診斷及治療帶進全新的領域。

作者貢獻：康潔紅提出研究思路及主要研究目標，參與試驗操作，進行統(tǒng)計學處理及繪制圖表，負責撰寫論文；巴濤、孫媛參與部分試驗操作；常向云、朱余蓉負責文章的質量控制，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。