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    紅景天苷抑制破骨細(xì)胞分化和極化的初步研究

    2022-04-02 07:57:06易清清梁鵬晨孫苗苗楊榮梁冬雨沙爽常慶
    天津醫(yī)藥 2022年3期
    關(guān)鍵詞:茜素骨細(xì)胞成骨細(xì)胞

    易清清,梁鵬晨,孫苗苗,楊榮,梁冬雨,沙爽,常慶△

    骨是一種礦化的結(jié)締組織,破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)在骨重塑和維持骨微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[1]。骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨量降低與骨微結(jié)構(gòu)退化為特點(diǎn)的疾病,骨折是其最常見(jiàn)的并發(fā)癥[2]。破骨細(xì)胞來(lái)源于造血干細(xì)胞,是由單核細(xì)胞融合分化而成,是唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞。破骨細(xì)胞通過(guò)分泌組織蛋白酶K(CK)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)降解骨基質(zhì)[3]。破骨細(xì)胞與骨組織接觸的細(xì)胞膜區(qū)域具有特殊的黏附結(jié)構(gòu),形成封閉區(qū),其中的細(xì)胞膜具有微絨毛結(jié)構(gòu)樣褶皺緣,兩者形成相對(duì)獨(dú)立的骨吸收間隙,從而完成細(xì)胞極化[4]。整合素(Integrin)能調(diào)節(jié)黏附、遷移及封閉區(qū)的形成,對(duì)破骨細(xì)胞分化和激活具有重要意義[5-6]。非受體酪氨酸激酶(c-Src)及其磷酸化產(chǎn)物p-Src 調(diào)節(jié)細(xì)胞極化、遷移及褶皺緣的形成,敲除c-Src的小鼠因體內(nèi)破骨細(xì)胞無(wú)法形成正常偽足,導(dǎo)致產(chǎn)生骨硬化癥[7-8]。紅景天苷(Salidroside,SAL)為4-羥基-苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷,是紅景天屬植物中廣泛存在的酚苷類(lèi)化合物,可從植物根、莖提?。?]。SAL具有保護(hù)心腦血管、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、促成骨等藥理作用[10]。近年來(lái)研究表明,SAL 可促進(jìn)骨折后的骨再生和血管生成[11]。有關(guān)SAL促成骨的研究多集中于促進(jìn)成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞活性方面,關(guān)于SAL 和破骨細(xì)胞分化及極化關(guān)系的研究尚少見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究SAL對(duì)可溶性核因子κB受體活化因子配體(sRANKL)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和極化的影響,以期為SAL的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 SAL購(gòu)自成都瑞芬思生物科技公司,小鼠單核細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞株購(gòu)自蘇州賽爾飛生物科技公司,高糖DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司,重組小鼠sRANKL購(gòu)自上海賽戈生物科技公司,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司,鬼筆環(huán)肽購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,DAPI和茜素紅染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司,兔源MMP-9、c-Src、CK、Integrin β3一抗及羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling 公司,實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)引物購(gòu)自上海捷瑞生物公司,RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京Takara公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠RAW264.7 細(xì)胞系用含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng),隔天換液,細(xì)胞密度80%以上時(shí)于6 孔板中鋪板培養(yǎng)。隨后細(xì)胞用含10%FBS,100μg∕L sRANKL 的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5 d。對(duì)照組不含SAL 的培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組分別加入含15、30 和60 mg∕L SAL 的培養(yǎng)液,于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng),隔日換液,連續(xù)培養(yǎng)5 d。本文中SAL 的質(zhì)量濃度15、30、60 mg∕L 均為加到細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度。

    1.2.2 TRAP 染色 細(xì)胞培養(yǎng)5 d 后,棄培養(yǎng)基,PBS 洗2 次,每孔加入500 μL 4%多聚甲醛固定30 min,PBS 洗2 次,按TRAP 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色,顯微鏡下觀察,對(duì)TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

    1.2.3 纖維形肌動(dòng)蛋白(F-Actin)環(huán)染色 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞系以1×105個(gè)∕孔的密度接種于6孔板中,細(xì)胞貼壁后分別更換含100μg∕L sRANKL 及0、15、30 和60 mg∕L SAL的DMEM培養(yǎng)基,于37 ℃、5%CO2環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h,棄培養(yǎng)基,PBS洗2次,4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗2次,加入5 mg∕L 鬼筆環(huán)肽染色液,37 ℃避光孵育30 min,棄染色液,PBS洗2次,加入DAPI染色液染色5 min,PBS洗2次。顯微鏡下觀察拍照,計(jì)數(shù)F-Actin環(huán)形成數(shù)。

    1.2.4 茜素紅染色 細(xì)胞以1×105個(gè)∕孔接種于6 孔板中,貼壁后分別換含100μg∕L sRANKL、成骨誘導(dǎo)液及0、15、30 和60 mg∕L SAL 的DMEM 培養(yǎng)基,于37 ℃、5%CO2環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d 后,吸除培養(yǎng)基,并用PBS 沖洗細(xì)胞,4%多聚甲醛中固定30 min,用茜素紅染色30 min,顯微鏡下觀察破骨細(xì)胞鈣化情況。顯微鏡拍攝后,用10%十六烷基氯化吡啶溶解,562 nm處測(cè)定光密度(OD)值。

    1.2.5 qPCR 檢測(cè)MMP-9、c-Src、CK和Integrin β3的mRNA表達(dá) 0、15、30和60 mg∕L SAL干預(yù)細(xì)胞5 d,使用Trizol法冰上抽提總RNA,根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄及cDNA的擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄條件:42 ℃15 min,85 ℃5 s。擴(kuò)增條件:95 ℃10 s;95 ℃3 s,60 ℃30 s,72 ℃34 s,循環(huán)40 次。以GAPDH 為內(nèi)參,目的基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。

    Tab.1 Amplification of gene primers by qPCR表1 qPCR擴(kuò)增基因引物序列

    1.2.6 Western blot 檢測(cè)MMP-9、c-Src 蛋白表達(dá) 0、15、30和60 mg∕L SAL 干預(yù)細(xì)胞5 d,在6 孔板中加入高效組織裂解液RIPA,冰上反復(fù)吹打,12 000 r∕min 離心10 min 后取上清液。上清液中加入上樣緩沖液,95 ℃加熱10 min 使蛋白變性,10%SDS-PAGE 分離蛋白后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,5%脫脂奶粉封閉抗原1 h,按說(shuō)明書(shū)稀釋一抗MMP-9(1∶1 000)、c-Src(1∶1 000),內(nèi)參GAPDH(1∶1 000),14 ℃孵育過(guò)夜,TBST 洗膜3 次,稀釋二抗(1∶20 000),室溫孵育1 h,TBST 洗膜3 次,加入ECL 化學(xué)發(fā)光液顯影曝光。根據(jù)灰度值數(shù)據(jù)分析各組MMP-9、c-Src蛋白相對(duì)表達(dá)量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用Dunnet-t檢驗(yàn),體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 SAL抑制RAW 264.7分化成TRAP 陽(yáng)性破骨細(xì)胞 在sRANKL誘導(dǎo)下,各組RAW264.7細(xì)胞均分化成破骨細(xì)胞,TRAP染色陽(yáng)性證實(shí)sRANKL誘導(dǎo)分化成功。與對(duì)照組相比,SAL 15、30 和60 mg∕L SAL 組TRAP染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞的數(shù)目逐漸減少,見(jiàn)圖1。

    Fig.1 The effect of different concentrations of salidroside on the count of osteoclasts(TRAP staining,×100)圖1 不同質(zhì)量濃度SAL對(duì)破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的影響(TRAP染色,×100)

    2.2 SAL 抑制RAW 264.7 分化破骨細(xì)胞F-Actin 環(huán)形成 對(duì)照組破骨細(xì)胞F-Actin環(huán)完整,SAL處理后,破骨細(xì)胞的F-Actin變細(xì),甚至消失。隨著SAL質(zhì)量濃度增高,破骨細(xì)胞的F-Actin 環(huán)破壞更加嚴(yán)重,F(xiàn)Actin環(huán)數(shù)量減少,破骨細(xì)胞的數(shù)目亦越少,見(jiàn)圖2。

    2.3 SAL促進(jìn)破骨細(xì)胞鈣化形成 隨著SAL質(zhì)量濃度增高,破骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色加深,SAL具有促進(jìn)破骨細(xì)胞鈣化的作用,見(jiàn)圖3。

    Fig.2 Effects of SAL on the formation of F-actin ring in osteoclasts圖2 不同質(zhì)量濃度SAL對(duì)破骨細(xì)胞F-Actin環(huán)形成的影響

    2.4 SAL 抑制MMP-9、c-Src、CK、Integrin β3mRNA的表達(dá) 與對(duì)照組相比較,30 和60 mg∕L SAL 組的MMP-9、CKmRNA,15、30 和60 mg∕L SAL 組的c-SrcmRNA,15、30 mg∕L SAL 組的Integrin β3mRNA 表達(dá)量降低(P<0.05),見(jiàn)表2。

    Tab.2 Comparison of mRNA expression levels of MMP-9,c-Src,CK and Integrin β3 between the four groups of osteoclasts表2 各組破骨細(xì)胞MMP-9、c-Src、CK、Integrin β3 mRNA表達(dá)水平比較 (n=3,±s)

    Tab.2 Comparison of mRNA expression levels of MMP-9,c-Src,CK and Integrin β3 between the four groups of osteoclasts表2 各組破骨細(xì)胞MMP-9、c-Src、CK、Integrin β3 mRNA表達(dá)水平比較 (n=3,±s)

    *P<0.05;a 與對(duì)照組比較,b 與15 mg∕L SAL 組比較,c 與30 mg∕L SAL組比較,P<0.05。

    組別對(duì)照組15 mg∕L SAL組30 mg∕L SAL組60 mg∕L SAL組F MMP-9 1.00±0.00 0.89±0.23 0.73±0.15ab 0.59±0.07abc 15.448*c-Src 1.00±0.00 0.78±0.18a 0.72±0.10a 0.64±0.12ab 22.874*CK 1.00±0.00 0.96±0.20 0.75±0.13ab 0.57±0.06abc 25.336*Integrin β3 1.00±0.00 0.87±0.28a 0.81±0.16a 0.91±0.18 9.612*

    2.5 SAL 抑制破骨細(xì)胞MMP-9、c-Src 蛋白表達(dá)水平 與 對(duì) 照 組 比 較,15、30 和60 mg∕L SAL 組 的MMP-9、c-Src蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05),見(jiàn)圖4、表3。

    Fig.3 Effects of SAL on alizarin red staining of osteoclast calcium nodules圖3 SAL對(duì)破骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色的影響

    Fig.4 Effects of SAL on MMP-9 and c-Src protein expression圖4 SAL對(duì)破骨細(xì)胞MMP-9、c-Src蛋白表達(dá)的影響

    3 討論

    骨是一種具有礦化能力的結(jié)締組織,在骨重塑和骨微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中,破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間存在信號(hào)傳導(dǎo)現(xiàn)象[11]。破骨細(xì)胞可以通過(guò)空泡腺苷三磷酸(ATP)酶、補(bǔ)體C3a、微小RNA 等影響成骨細(xì)胞骨形成;同時(shí),成骨細(xì)胞也可以通過(guò)骨保護(hù)素∕核因子受體活化因子∕核因子受體活化因子配體(OPG∕RANK∕RANKL)、死亡受體∕死亡配體(Fas∕FasL)等通路影響破骨細(xì)胞的分化與凋亡[12]。破骨細(xì)胞完成骨吸收主要是依靠其特有的超微結(jié)構(gòu),通過(guò)細(xì)胞骨架重組形成極化構(gòu)象,將細(xì)胞表面膜分成封閉區(qū)、褶皺緣、基底外側(cè)區(qū)和功能分泌區(qū)[13]。極化后的破骨細(xì)胞通過(guò)足質(zhì)體貼附于骨表面,同時(shí)F-Actin環(huán)圍繞褶皺緣形成獨(dú)立的微環(huán)境,CK 和MMP-9 等水解酶的釋放可以實(shí)現(xiàn)骨吸收[14]。

    Tab.3 Comparison of relative expression levels of MMP-9 and c-Src protein between the four groups表3 各組MMP-9、c-Src蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(n=3,±s)

    Tab.3 Comparison of relative expression levels of MMP-9 and c-Src protein between the four groups表3 各組MMP-9、c-Src蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(n=3,±s)

    **P<0.01;a與對(duì)照組比較,b與15 mg∕L SAL 組比較,c與30 mg∕L SAL組比較,P<0.05。

    組別對(duì)照組15 mg∕L SAL組30 mg∕L SAL組60 mg∕L SAL組F MMP-9 1.00±0.00 0.71±0.03a 0.53±0.10ab 0.28±0.02abc 35.368**c-Src 1.00±0.00 0.64±0.08a 0.42±0.05ab 0.14±0.04abc 52.159**

    中藥紅景天具有補(bǔ)腎、扶正固本、理氣養(yǎng)血和滋補(bǔ)強(qiáng)身等功效?,F(xiàn)代研究結(jié)果表明,紅景天含有40多種化合物,主要成分為SAL、酪醇等,具有抗缺氧、抗疲勞、抗腫瘤、抗病毒等作用[15-16]。研究還發(fā)現(xiàn),其主要活性成分SAL具有上調(diào)成骨細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的作用,能促進(jìn)成骨性的骨生成[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SAL 能夠抑制sRANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和極化、F-Actin環(huán)形成,促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)形成,抑制破骨細(xì)胞骨吸收關(guān)鍵蛋白酶MMP-9、c-Src 的活性,顯示出確切的抗骨質(zhì)疏松作用。

    基于SAL 確切的抑制骨吸收作用,本研究觀察了其對(duì)破骨細(xì)胞分化、極化和骨吸收的影響。破骨細(xì)胞由sRANKL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化而成。在破骨細(xì)胞分化和極化過(guò)程中,破骨細(xì)胞特異性表達(dá)骨吸收標(biāo)志蛋白MMP-9、c-Src 等[18]。MMP-9 為破骨細(xì)胞分泌的蛋白水解酶,參與細(xì)胞外膠原基質(zhì)的降解,維持破骨細(xì)胞的骨吸收功能。MMP-9 在哺乳動(dòng)物胚胎期軟骨內(nèi)成骨及骨重建時(shí)起到膠原酶的作用,是破骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞侵入礦化組織所必須的生物因子,破骨細(xì)胞分化過(guò)程中MMP-9 表達(dá)上調(diào),加速骨吸收[19]。因此,SAL可能通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá)來(lái)增加鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色程度。c-Src 及其磷酸化產(chǎn)物p-Src 參與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞極化及褶皺緣的形成。F-Actin 環(huán)是破骨細(xì)胞特有的進(jìn)行骨吸收的細(xì)胞骨架蛋白,反映了破骨細(xì)胞的骨吸收功能[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SAL 能顯著減少由sRANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞數(shù)目,抑制破骨細(xì)胞的分化與極化,減少F-Actin 環(huán)形成,促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)增多,降低破骨細(xì)胞的MMP-9 及c-Src 的表達(dá),表明SAL 能夠抑制破骨細(xì)胞骨吸收,減少骨丟失。

    綜上,本研究發(fā)現(xiàn),SAL能夠抑制破骨細(xì)胞的分化、極化和骨吸收作用,為SAL的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。本研究的不足之處是僅觀察了基因與蛋白水平的變化,尚未進(jìn)行相關(guān)信號(hào)通路的深入研究。另外,本研究?jī)H探究SAL 抑制體外破骨細(xì)胞的分化和極化,未通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),有待于后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

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