齒瓣石斛水提物對環(huán)磷酰胺免疫抑制模型小鼠的影響

周 濤，黃行行，趙瑩瑩，艾 馨，繆志敏，賴 泳

（大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000）

免疫低下會影響機(jī)體正常生理活動，引起各種疾病。免疫調(diào)節(jié)能力包括機(jī)體對外界生物侵入的抵抗能力、識別機(jī)體內(nèi)惡性細(xì)胞的探測能力以及消除體內(nèi)衰亡細(xì)胞和無用物質(zhì)的自我調(diào)節(jié)穩(wěn)定能力〔1〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)炎癥、腫瘤、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病的發(fā)生與免疫功能失調(diào)密切相關(guān)〔2〕。近年來，黃芪、金銀花、板藍(lán)根等傳統(tǒng)增強(qiáng)免疫力的中藥材研究逐漸成熟，石斛作為眾多提升免疫功能中藥中的一個新的熱點，受到了廣泛關(guān)注。

蘭科石斛屬植物是珍稀名貴中藥材，中國有近80種，被認(rèn)定具備藥用價值的種類已超過50種〔3〕。石斛具有免疫調(diào)控、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂等作用〔4〕。齒瓣石斛Dendrobium devonianumPaxt.俗稱紫皮石斛、紫皮蘭、香棍草，具有潤肺止咳、養(yǎng)胃生津功效，為藥用石斛的重要成員。研究表明齒瓣石斛水提取物（Dendrobium devonianumwater extract，DDWE）存在良好的體外抗菌作用，多糖成分一定程度上有提高小鼠免疫活性的能力〔5〕。近期相關(guān)研究提示，齒瓣石斛可能在免疫受損者的免疫功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，但并未闡明機(jī)體病理生理發(fā)生進(jìn)展過程〔6〕。因此本實驗構(gòu)建環(huán)磷酰胺（CTX）免疫抑制小鼠模型，通過DDWE對小鼠免疫功能的改變進(jìn)行研究，為齒瓣石斛進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF級健康昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 藥品與試劑 齒瓣石斛由云南省龍陵天中藥有限公司提供，經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室張德全教授鑒定為齒瓣石斛，DDWE由本實驗室提?。籆TX購自上海瀚思化工有限公司；胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基（雙蒸水配制）均購自美國Gibco公司，批號：1618862和1786045；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自Beyotime公司，批號：ST316；二甲基亞砜（DMSO）、凍存用DMSO和伴刀豆球蛋白A（ConA）均購自美國Sigma公司，批號：302A0325、RN13D8013和C8110；中性紅染色液、綿羊血紅細(xì)胞均購自南京森貝伽生物科技有限公司，批號：G1015、Sbjser99；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）購自Solarbio公司，批號：D804D044；NaHCO3、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）抗凝劑均購自天津市風(fēng)船生化材料有限公司；紅細(xì)胞（RBC）裂解液、CD3+抗體、CD4+抗體和CD8+抗體均購自美國Biolegened公司，批號：420301、10020350、10040750、10071125；稀釋液、鞘液、溶血劑均購自美國Millipore公司；免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）與白細(xì)胞介素-2（IL-2）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢驗試劑盒均購自南京建成生化試劑有限公司，批號：A0115、A0113、A0108、A0119、A0102。

1.3 儀器 MJ-54A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；LGJ-10F型冷凍干燥機(jī)（富陽市盛大機(jī)電有限公司）；311-CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific Forma公司）；CKX41倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；Synergy HT多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；GL-20M高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心器材有限公司）；XW-80A旋渦混合器（中國其林貝爾科技有限公司）；MPC-2000型96孔板離心機(jī)（Galanz公司）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）；XFA6100全血細(xì)胞分析儀（南京普朗儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 DDWE的制備 取齒瓣石斛生藥8 664.0 g，55℃干燥6 h，粉碎放入桶中，加60%乙醇溶液浸泡3 d，用雙層醫(yī)用紗布過濾，濾去藥渣，繼續(xù)加60%乙醇，反復(fù)操作共5次。將濾液旋蒸濃縮，得醇提物浸膏2 570.5 g，4℃恒溫密封保存。將剩余的藥渣取出，避光晾干、稱重得8 153.5 g，55℃干燥6 h，置于裝有純水煎鍋中，按照料液比1∶10的比例煎煮，沸騰后繼續(xù)煮1.5 h，過濾，得濾液，重復(fù)3次。合并所有水提物溶液，旋蒸濃縮并凍干，-40℃提前預(yù)凍，待水溶液均勻分布于凍干瓶內(nèi)壁，-80℃過夜。得水提物凍干粉858.579 g（得率10.53%），置于離心管中密封保存，備用。

2.2 實驗小鼠分組、造模及給藥 將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性對照組及DDWE低、中、高劑量組，第1、2、3天除空白組外，其余各組小鼠均腹腔注射0.04 g/kg CTX制備免疫抑制模型?？瞻捉M和模型組小鼠灌胃0.9%氯化鈉溶液0.02 g/（kg·d），陽性對照組灌胃0.04 g/（kg·d）的左旋咪唑，DDWE低、中、高劑量組分別灌胃0.25、0.50、1.00 g/（kg·d）的DDWE，1次/d，試驗周期30 d。

2.3 巨噬細(xì)胞制備及吞噬中性紅實驗 小鼠連續(xù)3 d腹腔注射5%可溶性淀粉1 mL，分泌腹腔巨噬細(xì)胞。第4天斷椎處死小鼠，75%乙醇中冷浸5 min，注入冷磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4），腹部剪口，吸出腹腔液置無菌離心管中，重復(fù)3次，收集小鼠腹腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入RBC裂解液，2 min后加PBS終止裂解，混合均勻后1 000 r/min離心5 min，棄上清，加PBS清洗，1 000 r/min離心10 min，棄上清，得純化巨噬細(xì)胞，加含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，混合均勻，得細(xì)胞懸液計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/孔。將上述巨噬細(xì)胞置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育，48 h后，待其充分緊貼內(nèi)壁，棄上清，溫PBS洗滌2次，每個加樣孔添加100μL中性紅染色材料（0.9%氯化鈉溶液稀釋），孵育30 min，棄上清，PBS沖洗2次，每孔添加100μL RBC裂解液（乙酸∶無水乙醇=1∶1），4℃過夜，測量540 nm處吸光度（OD）值，以O(shè)D值×10大小表示小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力。

2.4 脾臟指數(shù)與脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗 于實驗終點，小鼠稱重，斷椎處死，滅菌條件下取脾臟，0.9%氯化鈉溶液洗凈后擦干，稱重，計算脾臟指數(shù)（脾臟濕質(zhì)量/體質(zhì)量×10），后置于裝有滅菌PBS的培養(yǎng)皿中剪碎、研磨、過濾，收集濾液置離心管，1 200 r/min離心10 min，棄上清，加0.6 mL RBC裂解液裂解紅細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS、RPMI 1640培養(yǎng)基各洗1次，加RPMI 1640完全培養(yǎng)液（含10%FBS，青霉素、鏈霉素各100μg/mL）。為除去吞噬細(xì)胞將脾細(xì)胞置皮氏培養(yǎng)皿中37℃孵育1 h，收集非貼壁的脾淋巴細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整至1.5×106個/mL，臺盼藍(lán)染色測細(xì)胞存活率大于95%。對照孔中加RPMI 1640培養(yǎng)基100μL，ConA孔加ConA（15μg/mL）溶液100μL，每只小鼠設(shè)置3個平行孔，結(jié)束后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，48 h后取出細(xì)胞，每孔加20μL MTT（5 g/L），再次孵育4 h，取96孔板，1 000 r/min離心10 min，棄上清，每孔加150μL DMSO裂解細(xì)胞，37℃避光孵育10 min，490 nm處測定OD值，計算刺激指數(shù)（SI）。多項研究〔7-9〕使用SI代表小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力，S I值增加代表脾淋巴細(xì)胞增殖能力加強(qiáng)。

2.5 全血細(xì)胞分析與外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測末次灌胃后12 h，各組小鼠眼球取血，加入含100 μL飽和EDTA-Na2溶液的EP管中。全血經(jīng)過EDTA-N a2抗凝處理后采用血細(xì)胞分析儀測定外周血中各種血細(xì)胞數(shù)。每個樣本取出70μL裝入流式管，每個流式管中加10μL抗體，混合均勻后避光30 min，加1 mL RBC裂解液的稀釋液（原液∶雙蒸水=1∶9），混合均勻，避光孵育10 min，1 200 r/min離心5 min，棄上清，加3 mL FBS，避光10 min，1 200 r/min離心10 min，棄上清，加400μL FBS，流式細(xì)胞儀檢測CD4＋、CD8＋含量，計算CD4＋/CD8＋。

2.6 小鼠血清中IgG、IgA、IgM、TNF-α與IL-2的含量測定 實驗結(jié)束前1周，每只小鼠腹腔注射積壓綿羊血紅細(xì)胞0.2 mL，給藥7 d致敏小鼠。末次灌胃12 h后，眼球取不抗凝全血1 mL，置于EP管中，4℃靜置過夜，3 000 r/min離心10 min，取上清，為小鼠血清。根據(jù)ELISA說明指導(dǎo)中的操作規(guī)范進(jìn)行操作。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，不同組別對比采取單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DDWE對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能、脾臟指數(shù)與脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響 與空白組相比，模型組巨噬細(xì)胞吞噬功能、脾臟指數(shù)與脾淋巴細(xì)胞增殖能力顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，陽性對照組和DDWE中、高劑量組顯著促進(jìn)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性（P＜0.01）；陽性對照組和DDWE各劑量組顯著增強(qiáng)其脾臟指數(shù)（P＜0.05）；陽性對照組與DDWE高劑量組顯著增強(qiáng)其脾淋巴細(xì)胞增殖能力（P＜0.01）。與陽性對照組相比，DDWE低、中劑量組促進(jìn)免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性與提高脾臟指數(shù)的程度低（P＜0.05）；DDWE低劑量組增強(qiáng)其脾淋巴細(xì)胞增殖能力程度較低（P＜0.05）。見表1。

表1 DDWE對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能、脾臟指數(shù)與脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響（x±s，n=5）

3.2 DDWE對免疫抑制小鼠外周血細(xì)胞數(shù)與T淋巴細(xì)胞亞群的影響 與空白組比較，模型組小鼠外周血中白細(xì)胞、紅細(xì)胞與CD4＋/CD8＋水平均顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，陽性對照組與DDWE各劑量組中免疫抑制小鼠外周血白細(xì)胞與CD4＋/CD8＋水平顯著升高（P＜0.05）；陽性對照組能增強(qiáng)其外周血紅細(xì)胞水平（P＜0.05）。與陽性對照組相比，DDWE各劑量組提高免疫抑制小鼠外周血白細(xì)胞與CD4＋/CD8＋水平程度低（P＜0.05）；DDWE低、中劑量組增強(qiáng)其外周血紅細(xì)胞水平程度低（P＜0.01）。見表2、圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測圖（x±s，n=10）

表2 DDWE對免疫抑制小鼠外周血細(xì)胞數(shù)與T淋巴細(xì)胞亞群的影響（x±s，n=10）

3.3 DDWE對免疫抑制小鼠血清中IgG、IgA、IgM、TNF-α與IL-2水平的影響 與空白組相比，模型組小鼠血清中IgG、IgA、IgM、TNF-α與IL-2水平降低明顯（P＜0.01）。與模型組相比，陽性對照組、DDWE高劑量組能顯著增加免疫抑制小鼠血清中IgG水平（P＜0.01）；陽性對照組與DDWE各劑量組中IgA、IgM與IL-2水平顯著升高（P＜0.05）；陽性對照組及DDWE中、高劑量組中TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）。與陽性對照組相比，DDWE各劑量組提高免疫抑制小鼠血清中IgG、IgM、TNF-α與IL-2水平程度低（P＜0.05）；DDWE低劑量組增強(qiáng)其血清中IgA水平程度低（P＜0.01）。見表3。

表3 DDWE對免疫抑制小鼠血清中IgG、IgA、IgM、TNF-α與IL-2水平的影響（x±s，n=10）

4 討論

CTX可通過影響非特異性有絲分裂原ConA來抑制T淋巴細(xì)胞的增殖活性，間接影響B(tài)淋巴細(xì)胞的活化〔10〕。同時，CTX也會干擾血清中免疫細(xì)胞因子的產(chǎn)生〔11〕。此外，通過干擾DNA和RNA功能影響淋巴細(xì)胞的毒性也是其重要的免疫效應(yīng)〔12〕。

本研究發(fā)現(xiàn)IgG、IgA和IgM作為重要的人體免疫因子，介導(dǎo)針對病毒和細(xì)菌的天然免疫，刺激巨噬細(xì)胞以及促進(jìn)其對病毒和細(xì)菌的吞噬作用在體液免疫中發(fā)揮重要作用〔1，13〕。作為一種多效性炎癥細(xì)胞因子的TNF-α，不僅能激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等各種免疫細(xì)胞，增強(qiáng)其殺傷活性，還可以通過刺激具有免疫抑制作用的細(xì)胞發(fā)揮共抑制活性〔14〕。此外，免疫刺激因子IL-2，通過促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化與誘導(dǎo)淋巴因子激活殺傷細(xì)胞來控制免疫調(diào)節(jié)〔15〕。本實驗中，CTX免疫抑制小鼠血清中IgG、IgA、IgM、TNF-α和IL-2表達(dá)水平在DDWE給藥后呈劑量依賴性提高。與此同時，通過中性紅吞噬實驗，我們進(jìn)一步證實了DDWE能增強(qiáng)CTX免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，能顯著提高免疫抑制機(jī)體的非特異性免疫水平。眾多研究表明，中草藥可通過識別免疫細(xì)胞表面Toll樣受體（TLR4）激活細(xì)胞內(nèi)核因子κB（NF-κB）與絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路，導(dǎo)致免疫細(xì)胞因子的釋放進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用〔16-17〕。此外，霍山石斛多糖通過TLR4刺激NF-κB與抑制蛋白（IκB），使得IκB發(fā)生磷酸化降解，NF-κB迅速從細(xì)胞質(zhì)移位到細(xì)胞核，在核內(nèi)與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）基因上的κB位點結(jié)合，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞iNOSmRNA的表達(dá)，刺激巨噬細(xì)胞促進(jìn)TNF-α的分泌；也可以通過TLR4與配體結(jié)合，使MAPKs磷酸化，激活NF-κB，最后啟動轉(zhuǎn)錄促進(jìn)iNOS的表達(dá)，活化巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生〔18〕。本研究同樣發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞吞噬能力的增強(qiáng)與TNF-α分泌水平的提高顯著相關(guān)。因此，推測DDWE提高巨噬細(xì)胞吞噬活性可能與TLR4介導(dǎo)的NF-κB與MAPKs信號通路之間存在密切聯(lián)系，但具體的機(jī)制仍需更多基礎(chǔ)研究進(jìn)行驗證。

脾臟作為重要的外周免疫器官，是T、B淋巴細(xì)胞成熟、分化及免疫應(yīng)答的重要場所，其體積大小是評價非特異性免疫水平的一項重要指標(biāo)〔19〕。本實驗中，DDWE的使用顯著增加了脾臟指數(shù)，提高淋巴細(xì)胞增殖活性，改善機(jī)體免疫功能。結(jié)果表明，DDWE同樣能夠刺激免疫抑制機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。

白細(xì)胞是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)不可或缺的細(xì)胞，也是反映機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力的一項重要參考指標(biāo)〔20〕。免疫學(xué)研究中，CD4+代表輔助T淋巴細(xì)胞，協(xié)助B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及殺傷性T淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫功能；CD8+代表細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，可特異性殺傷靶細(xì)胞〔21〕。二者相互調(diào)節(jié)，在調(diào)控免疫反應(yīng)和維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，CD4+/CD8+的水平間接反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能。本實驗中，DDWE顯著提高免疫抑制小鼠CD4+/CD8+表達(dá)水平，使其由免疫抑制狀態(tài)向免疫功能正常狀態(tài)轉(zhuǎn)化，并且顯著增加免疫抑制小鼠白細(xì)胞數(shù)，這也更好地表明DDWE能顯著改善免疫抑制機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)針對CTX誘導(dǎo)的免疫功能抑制小鼠，DDWE能夠顯著增強(qiáng)其非特異性免疫、細(xì)胞免疫與體液免疫，其機(jī)制可能與TLR4介導(dǎo)NF-κB與MAPKs信號通路進(jìn)而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活性和促進(jìn)TNF-α分泌相關(guān)。這為齒瓣石斛在治療免疫系統(tǒng)疾病方面的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了實驗依據(jù)和潛在方向。