西歸粗多糖對缺氧小鼠抗氧化應(yīng)激作用的研究

何舒婷，張雨源，黃 會，肖 婕，楊興美

（1.大理大學藥學院，云南大理 671000；2大理大學體育科學學院，云南大理 671003）

由于現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快和生活方式的改變，處于亞健康狀態(tài)的人群日益增加，從而導致各類應(yīng)激性疾病的發(fā)生〔1〕。應(yīng)激反應(yīng)是指機體在接受應(yīng)激原后，為了減緩應(yīng)激原帶來的壓力，機體的神經(jīng)、免疫、分泌系統(tǒng)表現(xiàn)出生理和心理癥狀的應(yīng)答性反應(yīng)，從而維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。缺氧是應(yīng)激性疾病的一種重要應(yīng)激原。中國地形復雜，海拔高低不等，空氣中氧氣的含量也會隨之發(fā)生改變，人們因為學習、生活改變居住地時就可能出現(xiàn)缺氧而引起氧化應(yīng)激。因此研究應(yīng)激反應(yīng)機制，尋覓預(yù)防及減緩應(yīng)激性疾病的有效途徑就顯得尤為重要。

西歸是傘形科凹乳芹屬植物西藏凹乳芹Vicatia thibeticade Boiss的根，在云南大理作為中藥當歸的替代品，藥食兩用，又名獨腳當歸〔2〕。多項研究〔3-7〕發(fā)現(xiàn)西歸具有廣泛的藥理活性。西歸含有多糖、氨基酸及黃酮等物質(zhì)〔2〕，其中西歸粗多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、增強抗感染能力等作用〔8〕，且可改善力竭游泳后小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)，具有顯著抗疲勞作用〔4〕。本研究主要探討小鼠在缺氧狀態(tài)時，西歸粗多糖能否有效延長小鼠的存活時間及提高小鼠的抗氧化應(yīng)激能力，繼而為下一步西歸的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物SPF級昆明種小鼠128只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由昆明市艾尼莫實驗動物養(yǎng)殖中心提供，合格證號：SCXK（滇）2016-0002。飼養(yǎng)3 d后進行實驗。

1.2 主要試劑西歸粗多糖自制；紅景天苷購自南京春秋生物科技有限公司，批號：HJTG20171205；超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、一氧化氮（NO）測試盒、乙酰膽堿酯酶（AChE）測試盒均購自南京建成生物工程研究所，批號：20181203，20181203，20181206，20181206，20180714；無水乙醇、冰醋酸均購自天津市福晨化學試劑廠，批號：20170327，20171027。

1.3 儀器 EL104型梅特勒電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；TL-16R型臺式高速冷凍離心機（上海市離心機機械研究所）；EMP-168G半自動化分析儀（深圳市恩普電子技術(shù)有限公司）；HH·E21·Cu600電熱恒溫水溫箱（上海醫(yī)療器械七廠）；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

2 方法

2.1 西歸粗多糖的制備 西歸購于大理本地，由大理大學生藥教研室楊月娥高級實驗師鑒定。取干燥充分的西歸1 kg，粉碎后按1∶10料液比用85%乙醇在室溫下浸提3次，提取后的西歸進行再干燥，充分干燥后按料液比1∶10加入蒸餾水，隨后在85℃下加熱提取3次，1 h/次，4 500 r/min離心20 min，取上清液，60℃減壓濃縮至浸膏。將浸膏放入帶刻度的錐形瓶中量取體積，隨后與10倍體積的95%乙醇混合并攪拌均勻，室溫下靜置48 h，10 000 r/min離心10 min，沉淀用水溶解，濃縮，冷凍干燥后得西歸粗多糖，用苯酚-硫酸法檢測西歸粗多糖的含量〔8〕。

2.2 小鼠缺氧環(huán)境的制備取一只250 mL的廣口瓶，裝入10 g鈉石灰（成分：CaO 7.5 g，H2O 2.1 g，NaOH 0.3 g，KOH 0.1 g），瓶口取適量凡士林涂抹密封，并檢查氣密性。記錄小鼠存活時間的標準是從密封瓶蓋開始計時，直到小鼠死亡，即為缺氧存活時間〔9-10〕。

2.3 動物分組與給藥動物實驗分兩批次進行：第一批次小鼠隨機分成5組，每組10只，即：缺氧模型組、紅景天苷組（360 mg/kg）、西歸粗多糖低劑量組（100 mg/kg）、中劑量組（200 mg/kg）、高劑量組（400 mg/kg）。紅景天苷組和西歸粗多糖各劑量組灌胃相對應(yīng)的藥物7 d，1次/d，每次0.2 mL/10 g；缺氧模型組灌胃相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液。第二批次小鼠隨機分成6組，每組13只（兩批小鼠不是同時進行試驗，故需從第二批小鼠中隨機抽出3只，并測定這3只小鼠在缺氧環(huán)境下的存活時間，以此作為要給予小鼠缺氧時間的依據(jù)），分為正常組、缺氧模型組、紅景天苷組（360 mg/kg）、西歸粗多糖低劑量組（100 mg/kg）、中劑量組（200 mg/kg）、高劑量組（400 mg/kg）。紅景天苷組和西歸粗多糖各劑量組灌胃相對應(yīng)的藥物8 d（由于此次實驗對象為另外一批小鼠，其在同樣密閉缺氧環(huán)境下的存活時間可能會與第一批有所不同，為保證實驗嚴謹性，在給藥第7天時需要重新測定小鼠在缺氧環(huán)境下的存活時間，故需持續(xù)給藥8 d），1次/d，每次0.2 mL/10 g，正常組和缺氧模型組灌胃相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液作為對照。在第7天給藥30 min后，除正常組外，每組隨機抽取3只重復第一批次的實驗，記錄其存活時間，確定缺氧時間為20min。

2.4 小鼠在缺氧環(huán)境下存活時間的測定第一批小鼠末次給藥30 min后，將所有小鼠放入裝有10 g鈉石灰（成分同上）的250 mL廣口瓶中（1只/瓶），瓶口取適量凡士林密封，記錄小鼠的存活時間。

2.5 氧化應(yīng)激指標的測定第二批小鼠第8天給藥30 min后，將除正常組以外其他各組小鼠按照平行實驗的方法放入裝有10 g鈉石灰（成分同上）的250 mL廣口瓶中（1只/瓶），瓶口取適量凡士林涂抹，密封，給予20 min缺氧時間。20 min后，將小鼠從廣口瓶中取出，所有小鼠眼竇靜脈叢采血，血液4℃靜置30 min，分離血清（4℃，3 000 r/min，10 min）后，根據(jù)試劑盒操作說明書，分別測定血清中SOD、GSH-Px、AChE活性，MDA及NO含量。同時處死小鼠并取出肝臟，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液漂洗，取其相同部位約200 mg（（200±5）mg），在4℃下加0.9%氯化鈉溶液1.8 mL，用玻璃勻漿器研磨成組織勻漿〔11-14〕，按各試劑盒說明書測定SOD、GSH-Px、AChE活性及MDA含量。

2.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均以（x±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 西歸粗多糖含量的測定制得西歸粗多糖（灰白色粉末狀）320 g，提取率為32.00%。經(jīng)苯酚-硫酸法測得該樣品中多糖的含量為727.80 mg/g，純度為72.78%。

3.2 西歸粗多糖對小鼠缺氧環(huán)境中存活時間的影響紅景天苷組和西歸粗多糖各劑量組小鼠的存活時間均比缺氧模型組長（P＜0.05），說明給藥后可以延長小鼠在缺氧環(huán)境中的存活時間。西歸粗多糖中劑量組小鼠存活時間與紅景天苷組相近，而西歸粗多糖高劑量組小鼠的存活時間遠超過紅景天苷組（P＜0.01）。說明西歸粗多糖可以延長小鼠在缺氧環(huán)境中的存活時間，且呈劑量依賴性。見表1。

表1 西歸粗多糖對小鼠缺氧環(huán)境中存活時間的影響（x±s，n=10）

3.3 西歸粗多糖對小鼠血清中NO含量、AChE活性及MDA含量的影響與缺氧模型組相比，紅景天苷組、西歸粗多糖中、高劑量組小鼠血清中NO含量和AChE活性均下降（P＜0.05）；紅景天苷組及西歸粗多糖各劑量組小鼠血清中MDA含量均降低（P＜0.01），且西歸粗多糖各劑量組呈劑量依賴性降低。與紅景天苷組相比，西歸粗多糖各劑量組小鼠血清中NO含量有所升高（P＜0.05）；西歸粗多糖中劑量組小鼠血清中AChE活性與紅景天苷組相近，而西歸粗多糖高劑量組小鼠血清中AChE活性比紅景天苷組還低（P＜0.05）；西歸粗多糖中、高劑量組小鼠血清中MDA含量比紅景天苷組低（P＜0.01）。結(jié)果表明西歸粗多糖可有效減少小鼠血清中NO含量，降低AChE活性及MDA含量。見表2。

表2 西歸粗多糖對小鼠血清中NO含量、AChE活性及MDA含量的影響（x±s，n=10）

3.4 西歸粗多糖對小鼠血清中SOD和GSH-Px活性的影響與缺氧模型組相比，紅景天苷組和西歸粗多糖各劑量組均可提高小鼠血清中SOD活性，其中紅景天苷組和西歸粗多糖高劑量組作用明顯（P＜0.05）；紅景天苷組和西歸粗多糖各劑量組均可有效提高小鼠血清中GSH-Px活性（P＜0.05），且西歸粗多糖各劑量組呈劑量依賴性增加。與紅景天苷組相比，西歸粗多糖高劑量組的SOD活性更高（P＜0.05）；西歸粗多糖各劑量組的GSH-Px活性都比紅景天苷組高（P＜0.05），尤其是西歸粗多糖中、高劑量組的GSH-Px活性遠遠高于紅景天苷組。說明西歸粗多糖可以提高小鼠血清中SOD和GSH-Px活性。見表3。

表3 西歸粗多糖對小鼠血清中SOD和GSH-Px活性的影響（x±s，n=10）

3.5 西歸粗多糖對小鼠肝臟組織中AChE活性及MDA含量的影響與缺氧模型組相比，西歸粗多糖中劑量組小鼠肝臟組織中AChE活性降低（P＜0.05）；紅景天苷組、西歸粗多糖中、高劑量組小鼠肝臟組織中MDA含量均有所下降，且西歸粗多糖高劑量組與缺氧模型組小鼠肝臟組織中MDA含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與紅景天苷組相比，西歸粗多糖高劑量組小鼠肝臟組織中MDA含量明顯減少（P＜0.05）。提示西歸多糖可以降低小鼠肝臟組織中AChE活性，減少MDA含量。見表4。

表4 西歸粗多糖對小鼠肝臟組織中AChE活性及MDA含量的影響（x±s，n=10）

3.6 西歸粗多糖對小鼠肝臟組織中SOD和GSHPx活性的影響與缺氧模型組相比，紅景天苷組和西歸粗多糖各劑量組小鼠肝臟組織中SOD活性增加，且西歸粗多糖中、高劑量組與缺氧模型組小鼠肝臟組織中SOD活性差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；紅景天苷組及西歸粗多糖中、高劑量組小鼠肝臟組織中GSH-Px活性均增加，且西歸粗多糖高劑量組與缺氧模型組小鼠肝臟組織中GSH-Px活性差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與紅景天苷組相比，西歸粗多糖中劑量組小鼠肝臟組織中SOD活性與之相近，西歸粗多糖高劑量組小鼠肝臟組織中SOD活性增加更明顯（P＜0.05）；西歸粗多糖高劑量組小鼠肝臟組織中GSH-Px活性比紅景天苷組更高（P＜0.01）。說明西歸粗多糖不僅有效提高小鼠肝臟組織中SOD活性，同時也能提高小鼠肝臟組織中的GSH-Px活性。見表5。

表5 西歸粗多糖對小鼠肝臟組織中SOD和GSH-Px活性的影響（x±s，n=10）

4 討論

缺氧是一種病理過程，即組織的氧氣供給不足或利用阻礙都會導致組織的代謝、功能以及形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異樣變化〔15〕。通過測定小鼠在缺氧環(huán)境中的存活時間可以確定小鼠對缺氧的耐受力，小鼠的存活時間與小鼠的抗缺氧能力呈正相關(guān)，小鼠存活時間長說明具有良好的抗氧化應(yīng)激能力〔16〕。本研究顯示，西歸粗多糖各劑量組均能延長小鼠在缺氧環(huán)境下的存活時間，并且西歸粗多糖高劑量組小鼠存活時間更是遠超過紅景天苷組，提示西歸粗多糖可能具有抗缺氧作用。推測這種作用可能是小鼠在缺氧環(huán)境下對氧的利用能力被提高，用以彌補氧氣供給不足或利用阻礙帶來的缺陷，減緩了小鼠因缺氧而引起組織機能損傷狀況的速度，提高小鼠的抗缺氧能力，進而延長小鼠在缺氧狀態(tài)下的存活時間。為驗證這個猜測，我們設(shè)計了接下來的一系列氧化應(yīng)激指標的測定試驗。

SOD可以將生物體內(nèi)活性氧自由基轉(zhuǎn)換為氧氣和過氧化物，檢測SOD的含量可以反映機體活性氧自由基的清除率〔17〕。GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化酶，它可阻斷活性氧自由基對機體的進一步損傷〔18〕。機體缺氧會產(chǎn)生大量的氧自由基，從而消耗SOD及GSH-Px并抑制其活性，故發(fā)生脂質(zhì)過氧化后產(chǎn)生大量的MDA〔14〕。因此，MDA也常常作為反映氧化損傷程度的標志物〔19-21〕，大量的MDA會破壞生物膜的完整性，加劇膜損傷。本研究表明，在缺氧狀態(tài)下，用西歸粗多糖預(yù)防給藥后，小鼠肝臟和血清中SOD活性和GSH-Px活性均升高，而MDA的含量降低，表明西歸粗多糖可有效治療因氧化應(yīng)激而引起的損傷。

研究表明，在正常情況下，NO對于神經(jīng)的作用具有兩面性，既可起到保護作用，又可毒害神經(jīng)〔22〕。在NO高濃度下，二氧化氮自由基、羥自由基會大量產(chǎn)生，從而使蛋白質(zhì)、核酸、細胞膜遭到破壞，線粒體損傷加劇，進而誘導細胞走向凋亡〔23〕。故此，降低NO的濃度，可明顯增加抗氧化能力，從而減少氧化應(yīng)激引起的損傷。本研究表明，西歸粗多糖高劑量組可以有效降低小鼠血清中NO的含量，這與多項研究結(jié)果一致〔24-26〕。而低劑量組的NO含量比缺氧模型組高，這可能是小鼠缺氧時，NO含量還受到其他代償調(diào)節(jié)作用，進而影響小鼠血清中NO的含量。

AChE是乙酰膽堿的一種水解酶。肝臟生成膽堿酶后分泌入血，所以肝受損害的程度可由膽堿酶的表達量來反映。本研究數(shù)據(jù)顯示，西歸粗多糖對小鼠缺氧狀態(tài)下肝細胞和血清中AChE的活性有一定影響，主要是緩解小鼠在缺氧時組織細胞的損傷程度，提高氧的利用能力。另外，課題組前期的研究表明西歸粗多糖也可以通過調(diào)節(jié)免疫功能和免疫平衡，減輕肝臟損傷，對運動疲勞發(fā)揮積極的免疫調(diào)節(jié)作用〔27〕，這兩條對肝臟調(diào)節(jié)路徑之間的相互作用還需要深入研究。

綜上所述，本研究表明西歸粗多糖可以通過增強缺氧小鼠SOD及GSH-Px活性，降低小鼠的AChE活性，減少MDA及NO含量，減輕小鼠體內(nèi)自由基的氧化損傷，從而對缺氧條件下的小鼠提供保護。總之，西歸粗多糖具有抗缺氧作用，可能與其可減輕氧化損傷的作用有關(guān)。但本研究僅僅是初步探索了西歸粗多糖3個劑量組與抗氧化作用的關(guān)系，因西歸粗多糖分子質(zhì)量大，結(jié)構(gòu)復雜，提取純度并沒有達到100%，所以具體到抗氧化作用的發(fā)揮是與西歸粗多糖的哪些結(jié)構(gòu)部位有關(guān)及作用于哪些生物信號等都需要進一步研究。