Caspase12和Caspase3在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的HCC細胞凋亡中的作用*

溫靜靜， 董玉娟， 王大壯， 王世凱， 陳紅芳

(1.濰坊市益都中心醫(yī)院 病理科， 山東 濰坊 262500； 2.濰坊市益都中心醫(yī)院 肝膽外科， 山東 濰坊 262500)

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一類死亡率較高的原發(fā)性肝癌，是起源于肝細胞的惡性腫瘤，對人類健康形成了極大威脅，尋找有效治療方法的研究一直備受關(guān)注[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的HCC會發(fā)生自發(fā)性癌細胞凋亡[2]，且惡性程度越高凋亡指數(shù)越大[3]，提示通過調(diào)控HCC組織的細胞凋亡可對HCC的治療成為可能。研究認為，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可通過調(diào)控多種細胞信號通路介導了腫瘤組織細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展[4-7]，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)常常作為細胞發(fā)生ERS的標志，當ERS發(fā)生時，GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜上3種跨膜蛋白解離而啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)等相關(guān)級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡[8]。Caspase家族成員被公認在細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮中心作用，尤其是Caspase3作為細胞凋亡執(zhí)行者，其激活機制的研究對于調(diào)節(jié)細胞凋亡的發(fā)生有著重要意義[9]。Caspase12是特定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上的促凋亡分子，在發(fā)生ERS相關(guān)凋亡過程中，Caspase12活化是其核心環(huán)節(jié)之一[10]，本文研究ERS介導的HCC細胞凋亡過程中，Caspase3與Caspase12的表達水平的變化，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1一般資料 標本和臨床資料來自醫(yī)院病理分級為Ⅰ-Ⅱ級(高分化)、Ⅲ-Ⅳ級(低分化)HCC組織標本各25份，總共50份標本中隨機選取25份HCC標本的癌旁組織(距病灶2 cm的組織)作為癌旁對照組，標本均為2018—2019年手術(shù)病人切除的組織，-80 ℃速凍保存。男29例、女21例，年齡33～78歲、平均62歲。相關(guān)標本采集及使用符合人體標本研究相關(guān)倫理學要求。

1.1.2主要試劑 GRP78、Caspase3、Caspase12抗體，免疫組化Envision二抗檢測試劑盒、原位末端標記法(TUNEL)檢測試劑盒、Millipore NC膜0.45 μm孔徑均購自北京Bioss技術(shù)有限公司，SYBRGreen購自大連TaKaRa公司，Tris-Glycine-SDS電泳緩沖液購自美國賽墨飛世兒科技公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大富酶泰斯公司，GRP78、Caspase3、Caspase12和β-actin引物由上海生物工程公司合成。引物序列如下見表1。

表1 不同目的基因引物序列Tab.1 Primer sequences of different target genes

1.2 研究方法

1.2.1肝組織病理學檢查 肝組織采用10%福爾馬林固定、乙醇脫水并進行組織石蠟包埋，蘇木素-伊紅染色后觀察肝臟組織病理變化。

1.2.2TUNEL法檢測肝組織中肝細胞凋亡 按照試劑盒說明書操作，在熒光顯微鏡下觀察凋亡的細胞，以胞核發(fā)綠色熒光的細胞作為凋亡細胞，并計算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=(凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。

1.2.3免疫組化檢測肝組織中GRP78、Caspase3及Caspase12蛋白表達 組織標本常規(guī)脫蠟水化，去離子水孵育后，分別滴加GRP78、Caspase3及Caspase12抗體(濃度比均為1 ∶100)，4 ℃過夜，次日37 ℃二抗孵育0.5 h，DAB顯色，蘇木素復染，磷酸鹽緩沖液處理作為陰性對照，計算陽性細胞百分比(N)，N=(n陽/n總)×100%。(n陽為顯微鏡下隨機抽取5個視野觀察胞漿黃染的細胞，n總為5個視野觀察細胞總數(shù))。

1.2.4Real-time PCR檢測GRP78、Caspase3及Caspase12 mRNA表達 采用雙股DNA結(jié)合熒光系統(tǒng)(SYBRGreen)，按Thermo K1622逆轉(zhuǎn)錄反應試劑盒規(guī)范操作，20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應體系為總RNA 1.0 μg、5×PCR Buffer 4.0 μL、dNTP 2.0 μL、Oligod(T) 1.0 μL、RNase Inhibitor 1.0 μL、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL、無RNA酶H2O補足體積，反應條件為25 ℃ 10 min、48 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min；25 μL Real-time PCR反應體系為2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、Cdna 2.0 μL、無RNA酶H2O 8.5 μL，反應條件為預變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣本設置2個復孔，實驗重復3次，mRNA的相對表達量以2-ΔΔCt表示。

1.2.5Western Blot法檢測肝組織中GRP78、Caspase3及Caspase12 蛋白表達 將制備好的蛋白樣品每孔加樣 8.0 μL。膜孔徑轉(zhuǎn)膜，制作濕式轉(zhuǎn)膜“三明治”；用封閉液(脫脂奶粉)室溫封閉90 min，將鼠抗GRP78、Caspase3及Caspase12分別按照1 ∶800、1 ∶1 000、1 ∶1 000比例稀釋，4℃孵育過夜，搖床速度20～30次/min。次日回收一抗，TBST洗膜，6 min×3 次，二抗稀釋液稀釋二抗，抗兔IgG抗體(1 ∶20 000)常溫孵育60 min，采用ODYSSEY Fc imaging system顯色，拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 HCC組織病理學變化

HE染色顯示，HCCⅠ-Ⅱ級組HCC癌細胞呈細梁索狀排列，細胞輕度異型，胞漿豐富，輕度嗜堿性，胞核大，核漿比值增大，核仁明顯，少量核分裂象；HCCⅢ-Ⅳ級組HCC癌細胞呈粗梁索狀或雜亂排列，細胞異型明顯，細胞核大、不規(guī)則，核分裂象易見，查見巨核或怪狀核；癌旁組織肝細胞索排列規(guī)則。見圖1。

2.2 細胞凋亡

TUNEL法檢測各組標本的細胞凋亡情況，結(jié)果表明HCCⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級組中細胞凋亡的數(shù)目明顯增加，與癌旁對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 GRP78、Caspase3及Caspase12蛋白表達

免疫組化檢測結(jié)果顯示，GRP78、Caspase3及Caspase12蛋白主要在細胞漿中，HCCⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級組標本中Caspase3及GRP78的表達較癌旁組織增多(P<0.05)；在癌旁對照、HCCⅠ-Ⅳ級、Ⅲ-Ⅳ級組中，Caspase12表達未見明顯差異(P>0.05)。見圖3、圖4。Western Blot檢測結(jié)果顯示，與癌旁對照組相比，HCCⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級組中GRP78、Caspase3蛋白表達增加(P<0.05)，而各組標本的Caspase12蛋白比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。見圖5。

2.4 GRP78、Caspase3及Caspase12 mRNA表達

結(jié)果顯示，HCCⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級組中Caspase3及GRP78 mRNA的表達水平較癌旁對照組織增多(P<0.05)；在各組組織中Caspase12 mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5。

3 討論

HCC因高發(fā)病率、高死亡率備受各學者關(guān)注，其發(fā)病機制與機體乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和脂肪性肝炎、酒精性肝炎等慢性炎癥相關(guān)[11-12]。各種理化生物因素作用細胞后出現(xiàn)炎癥及氧化應激損傷甚至對基因產(chǎn)生影響，進而直接或間接引發(fā)ERS[13]。ERS是一種信號反應通路系統(tǒng)，是細胞的一種保護機制[14]。生理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的3類跨膜蛋白，即蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK) 、1型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)膜蛋白激酶(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)，與GRP78(BiP)結(jié)合，處于失活狀態(tài)[15-16]；當發(fā)生ERS時，3條信號通路相繼被激活。早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是促生存響應，過強或持續(xù)時間過長的未折疊蛋白反應會促進增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表達引起細胞凋亡[17-18]，除CHOP介導細胞凋亡外，JNK信號通路及Caspase12通路也可介導凋亡[19-20]，Caspase12是由ERS誘導細胞凋亡的調(diào)節(jié)蛋白，由內(nèi)質(zhì)膜轉(zhuǎn)位到細胞質(zhì)，對Casase9酶原進行切割以使之活化，進而順序激活Caspase3等效應Caspasese[21-22]。關(guān)于HCC發(fā)生發(fā)展過程中受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導，是否激活Caspase12誘導的細胞凋亡通路的研究少有報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，無論高分化還是低分化HCC組織的細胞凋亡均明顯高于癌旁組織，說明HCC的發(fā)生伴隨有細胞凋亡的增加，與其他研究報道一致。同時，HCCⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級肝組織中GRP78 mRNA和蛋白表達與癌旁組織比較均有增多，表明在HCC組織細胞凋亡增加的同時，細胞發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激也是增強的，因此說明ERS介導了HCC細胞凋亡的發(fā)生；而Caspase3在HCCⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級肝組織中mRNA和蛋白表達與癌旁肝組織比較有顯著增高，并且HCC Ⅰ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級肝組織中細胞凋亡比例隨著惡性程度的升高而增加，從而進一步表明ERS介導HCC細胞凋亡是通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路從而激活Caspase3執(zhí)行細胞凋亡的可能。但本研究還發(fā)現(xiàn)，HCCⅠ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級肝組織中Caspase12 mRNA和蛋白表達與癌旁肝組織比較無顯著變化，提示人HCC細胞凋亡發(fā)生且Caspase3的激活是ERS介導Caspase12以外的信號通路進行的，與前期在動物模型水平研究發(fā)現(xiàn)有所不同[23]，結(jié)合其他研究報道分析，Caspase12作為ERS中啟動凋亡程序的一種特異蛋白酶，在以嚙齒類動物為代表的的其他動物體內(nèi)表達發(fā)揮重要作用，而在人體中Caspase12可能因喪失其酶活性不能發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)作用[24-25]。因此推測人體HCC發(fā)生細胞凋亡過程中，作為核心環(huán)節(jié)的Caspase3活化是ERS介導Caspase12以外的信號轉(zhuǎn)導途徑所致。

綜上所述，在HCC發(fā)生發(fā)展過程中，ERS誘導的細胞凋亡參與其中，并且是通過Caspase12以外信號轉(zhuǎn)導途徑激活Caspase3實現(xiàn)的，這為今后尋找有效調(diào)節(jié)細胞凋亡從而發(fā)揮治療HCC的研究拓寬了思路，并提供了一定的理論依據(jù)。