綠茶有效組分固定劑量聯(lián)合對(duì)牙周炎大鼠的治療效果*

莫漢佳， 李智炫， 黃斯銘， 吳子湘， 何勇， 薛子軒， 辛冰艷， 周冬華**

(1.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410219; 2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)系， 湖南 長(zhǎng)沙 410205)

牙周炎是兼具感染性、自愈性、系統(tǒng)性特征的常見口腔疾病，與患者口腔不良衛(wèi)生、飲食習(xí)慣以及外界刺激等因素有關(guān)，由于病情反復(fù)而長(zhǎng)期困擾患者，其病程遷延會(huì)導(dǎo)致系列并發(fā)癥的發(fā)生，重者出現(xiàn)牙齦嚴(yán)重萎縮、牙齒脫落[1-2]。我國(guó)居民飲茶歷史悠久，茶中富含多種人體必需的微量元素，適量飲茶有祛熱利便、殺菌解毒以及降脂促消等功效[3-4]。國(guó)內(nèi)流調(diào)數(shù)據(jù)顯示，適量飲茶有助于降低牙周炎發(fā)病率[5]，為進(jìn)一步探查綠茶中主要組分對(duì)牙周炎疾病的治療效果及聯(lián)用差別，對(duì)288只牙周炎模型大鼠進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及造模

2019年2月—2020年6月選取SD大鼠，2月齡，雌雄各半，體質(zhì)量203～245 g、平均(220.13±12.01)g，由長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，編號(hào)43006700019859；室內(nèi)培養(yǎng)溫度維持(26.0±2.0)℃，濕度維持(35.0±5.0)%，采取標(biāo)準(zhǔn)光照射。根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]方法，采用結(jié)扎絲壓迫牙齦的方式建立大鼠牙周炎動(dòng)物模型，具體方法：大鼠腹腔注射10%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉后固定于手術(shù)板，采用根管銼(15-30#K型)剝離大鼠第一磨牙和第二磨牙的牙齦，同時(shí)適當(dāng)擴(kuò)大兩顆牙齒之間的牙間隙，而后采用雙股絲線結(jié)扎兩顆磨牙，并保持結(jié)扎線處于齦溝內(nèi)，最后使用根管銼配合手術(shù)刀離斷磨牙下方牙槽的神經(jīng)。成功造模標(biāo)準(zhǔn)：全口牙平均附著喪失0.6～1.5 mm，鄰面牙平均附著喪失<3 mm。成功造模288只牙周炎大鼠。本研究獲得長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理備案(備案號(hào)2020069)。

1.2 研究方法

1.2.1分組處理 采用隨機(jī)數(shù)字表分為9組，研究全程未發(fā)生大鼠死亡，體質(zhì)量、雌雄、月齡構(gòu)成均衡(P>0.001)，藥物配置方法見表1，8種藥物分別加入8組大鼠日常飲用水(300 mL)中，連續(xù)干預(yù)5 d。

表1 9組大鼠飲用水配制方法Tab.1 Configuration of drinking water for rats of the 9 groups

1.2.2數(shù)據(jù)收集 干預(yù)前和干預(yù)后分兩次采集大鼠的齦溝液和血液標(biāo)本，每次取樣前均使用乳化異氟烷(液態(tài)異氟烷1.2 mL+30%脂肪乳21.3 mL)腹腔注射麻醉。齦溝液標(biāo)本：無(wú)菌潔治器械清除大鼠牙菌斑，使用氣槍對(duì)相鄰牙齦組織和牙頰面進(jìn)行干燥，將無(wú)菌濾紙插入取樣牙周袋內(nèi)約1 mm，30 s后取出濾紙放入Eppendorf小管(無(wú)熱源)中密封(若濾紙條帶血?jiǎng)t取樣不合格)，冰凍(5 ℃以下)送檢；脂聯(lián)素(adipose tissue，ADP)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)、內(nèi)毒素(endotoxin，RSE)用鱟實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)。血液標(biāo)本：大鼠空腹?fàn)顟B(tài)下抽尾部靜脈血，1 000 r/min離心15 min，獲得上層血清，用PUZS 300A/X全自動(dòng)生化檢測(cè)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-17(interleukin 17，IL-17)含量[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)前后齦溝液中ADP和RSE含量

相比干預(yù)前，干預(yù)后單用1組、單用2組、聯(lián)用1組、聯(lián)用2組、聯(lián)用3組、聯(lián)用4組ADP含量升高，而RSE含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；干預(yù)后ADP含量，單用1組和單用2組高于空白組、聯(lián)用1組高于單用1組、聯(lián)用2組高于單用2組、聯(lián)用4組高于單用2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.803、4.856、5.863、5.751、3.921，P<0.001)。干預(yù)后RSE含量，單用1組和單用2組低于空白組、聯(lián)用1組低于單用1組、聯(lián)用2組低于單用2組、聯(lián)用4組高于單用2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.781、3.835、17.434、15.839、9.407，P<0.001)。見表2。

表2 9組大鼠干預(yù)前后齦溝液中ADP和RSE含量比較Tab.2 Comparison of ADP and RSE contents in gingival crevicular fluid of rats before and after

2.2 干預(yù)前后血清TNF-α、IL-17含量

相比干預(yù)前，干預(yù)后單用1組、聯(lián)用1組、聯(lián)用2組、聯(lián)用3組、聯(lián)用4組TNF-α含量降低，單用1組、單用2組、單用3組、單用4組、聯(lián)用1組、聯(lián)用2組、聯(lián)用3組、聯(lián)用4組IL-17含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。干預(yù)后TNF-α含量，單用1組低于空白組、聯(lián)用2組低于單用2組、聯(lián)用4組低于單用2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.814，8.838、6.946，P<0.001)。干預(yù)后IL-17含量，單用1組、單用2組、單用3組、單用4組低于空白組，聯(lián)用1組低于單用1組、聯(lián)用2組低于單用2組、聯(lián)用4組低于單用2組，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.917、4.624、8.213、5.150，5.288、13.710、8.289；P<0.001)。見表3。

2.3 綠茶4種組分兩兩聯(lián)合使用時(shí)相加交互作用

綠茶4種組分兩兩聯(lián)合使用，均存在相加交互作用，交互作用強(qiáng)度由強(qiáng)到弱依次為茶多酚聯(lián)用鋅(AP=70.27)、茶多酚聯(lián)用鐵(AP=21.66)、咖啡堿聯(lián)用鋅(AP=13.80)、咖啡堿聯(lián)用鐵(AP=12.21)。見表4。

表3 9組大鼠干預(yù)前后血清TNF-α、IL-17含量比較Tab.3 Comparison of serum TNF-α and IL-17 contents in the 9 groups before and after intervention

表4 綠茶4種組分兩兩聯(lián)合使用時(shí)相加交互作用結(jié)果Tab.4 The effects of interaction of the four components in green tea

3 討論

綠茶組分構(gòu)成繁雜，不同組分有效含量差異巨大，現(xiàn)有研究可知，綠茶中的茶多酚、單寧酸均有抑制細(xì)菌、護(hù)牙釉質(zhì)的功效。我國(guó)諸多地區(qū)尤其是南方丘陵地帶具有悠久的種茶、飲茶、用茶習(xí)俗，古藥方中也有將綠茶用于心血管疾病、炎性疾病治療的記載[9-10]。隨著物質(zhì)組分分離和高純提取技術(shù)不斷進(jìn)步，綠茶中的主要有效組分愈發(fā)明確，其中2種有機(jī)物(茶多酚、咖啡堿)和2種微量元素(鋅、鐵)的含量相對(duì)較高[11-12]。充分了解4種物質(zhì)單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)牙周炎大鼠產(chǎn)生的具體影響，將有助于科學(xué)宣教綠茶功效，并為其在口腔疾病上的藥用提供一定理論支撐。

研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)后的單用1組、單用2組和4組聯(lián)用組ADP含量升高，而RSE含量降低，說(shuō)明茶多酚和咖啡堿對(duì)局部細(xì)菌的抑制作用尤為明顯。牙菌斑中的革蘭陰性菌是引發(fā)宿主產(chǎn)生嚴(yán)重免疫反應(yīng)或炎性改變的重要誘因，其能持續(xù)排放RSE而侵襲牙周組織或牙槽骨質(zhì)，甚至直接損害牙齦成纖維細(xì)胞的活力[13-14]。ADP則是由脂肪細(xì)胞少量分泌的，具有高度特異性的胰島素增敏激素，其能持續(xù)影響促炎因子的刺激反應(yīng)和抗炎效果，因此被當(dāng)做人體的保護(hù)性細(xì)胞因子[15]。茶多酚抗菌效果實(shí)現(xiàn)主要與其能降低細(xì)菌葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的生理活性、減少牙齒表面細(xì)菌黏附有關(guān)，部分口腔科應(yīng)用的光譜殺菌劑適量添加了茶多酚組分，發(fā)現(xiàn)添加該物質(zhì)后，殺菌劑能更好的調(diào)節(jié)口腔菌群，并減輕藥劑的粘膜刺激性[16]?？Х葔A由黃嘌呤生物堿與茶黃素兩種物質(zhì)締合而成，是茶湯飲入時(shí)產(chǎn)生苦感的風(fēng)味物質(zhì)。綠茶中咖啡堿含量保持在2.69%～3.11%[17]，既往研究認(rèn)為該物質(zhì)主要功效是緩解疲勞及神經(jīng)興奮[18]。本研究發(fā)現(xiàn)咖啡堿亦有一定的抗菌功效，其發(fā)揮效果的主要機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞JMJD3-IRF4軸而促進(jìn)抗菌功效得以實(shí)現(xiàn)的[19]，具體生理機(jī)制仍需探究。

研究還發(fā)現(xiàn)，綠茶中的茶多酚或鋅元素單獨(dú)使用時(shí)具有不同程度的抗炎功效。茶多酚是綠茶產(chǎn)品價(jià)值最大化的主要關(guān)鍵點(diǎn)及宣傳點(diǎn)，實(shí)際上茶多酚是多酚類物質(zhì)元素的集合體，黃烷醇類和酚酸類則是茶多酚中兩種最主要功效成分[20]。茶多酚發(fā)揮抗炎作用主要與稠環(huán)芳香烴有效抑制了唾液中淀粉酶的活性，從而快速阻斷淀粉食物糖的的供給途徑有關(guān)[21]。此外，茶多酚亦可以影響細(xì)菌表面脂磷壁酸的產(chǎn)生和消除過(guò)程，從而在抑制細(xì)菌增殖層面來(lái)緩解炎癥程度。鋅元素發(fā)揮組織局部抗炎作用主要與影響糖皮質(zhì)激素受體活性，進(jìn)而抑制白細(xì)胞貼壁活化過(guò)程有關(guān)[22]。

重點(diǎn)分析聯(lián)合組抗菌、抗炎效果的優(yōu)勢(shì)性。干預(yù)后比較發(fā)現(xiàn)ADP含量的變化為聯(lián)用1組高于單用1組、聯(lián)用2組高于單用2組、聯(lián)用4組干預(yù)單用2組，而TNF-α含量變化為聯(lián)用2組低于單用2組、聯(lián)用4組低于單用2組；無(wú)論何種搭配，從整體來(lái)看茶多酚聯(lián)用鐵元素、鋅元素均有益于抗菌效果的充分發(fā)揮，而咖啡堿聯(lián)合鋅元素對(duì)抗菌效果則有確切的加強(qiáng)作用。與不同物質(zhì)發(fā)揮抗菌作用的途徑存在顯著差別有關(guān)，茶多酚聯(lián)合鋅元素能最大程度控制金屬基質(zhì)蛋白酶的活性，從而減少骨組織的被動(dòng)吸收過(guò)程，組織修復(fù)加速也能增強(qiáng)抗菌作用[23]。而咖啡堿聯(lián)合鋅元素發(fā)揮作用的基礎(chǔ)可能與鋅元素有關(guān)，這兩種物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生交互作用的機(jī)制值得研究。

同時(shí)，聯(lián)用2組或聯(lián)用4組大鼠血清中TNF-α含量低于單用2組，而聯(lián)用1組IL-17含量低于單用1組，聯(lián)用2組IL-17含量低于單用2組，聯(lián)用4組IL-17含量低于單用2組，該組數(shù)據(jù)說(shuō)明茶多酚聯(lián)用鐵元素、鋅元素能增強(qiáng)抗炎作用。該結(jié)果與表3進(jìn)行的相加交互作用分析結(jié)果相一致，進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，相加交互作用強(qiáng)度由高到低依次為茶多酚聯(lián)用鋅、茶多酚聯(lián)用鐵、咖啡堿聯(lián)用鋅、咖啡堿聯(lián)用鐵。因此在綠茶應(yīng)用過(guò)程中，無(wú)論選擇何種有效組分，均不能忽視茶多酚的基礎(chǔ)、核心功效[24]，而適當(dāng)添加輔料則可能有益于綠茶藥效的進(jìn)一步提升。

本研究由于經(jīng)費(fèi)有限，大鼠培養(yǎng)和研究時(shí)間相對(duì)較短，所以具有一定的局限性，僅能觀察獲得綠茶4種組分的短期應(yīng)用效果。同時(shí)，為簡(jiǎn)化操作步驟，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的4種組分為標(biāo)準(zhǔn)品搭配而成，并非直接使用綠茶提取有效物質(zhì)，所得結(jié)論具有一定偏倚的可能。