機械通氣導致小鼠認知障礙時對自噬和NLRP3炎癥小體的影響*

張晗， 陳婷， 陳暢， 唐李娟， 陳瑩瑩， 鐘琦， 張宗澤

(武漢大學中南醫(yī)院 麻醉科， 湖北 武漢 430071)

機械通氣是危重癥患者呼吸道管理的重要手段，可導致機械通氣相關性肺損傷(ventilator-induced lung injury, VILI)和包括腦在內的遠隔器官功能障礙[1]。自噬是維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定的一種自我保護機制，用于隔離和降解細胞溶質大分子和受損細胞器，最近的研究證實巨噬細胞自噬參與炎癥反應的精細控制[2]。Nod樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體是一種存在于細胞質中的蛋白復合物，可觸發(fā)效應蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)的激活從而促進促炎細胞因白細胞介素(interleukin，IL)1β和IL-18的成熟和釋放，并引起炎癥反應[3]。本課題組前期研究證實，機械通氣6 h后即刻小鼠腦組織自噬水平增強[4]；也有研究表明，機械通氣時NLRP3炎癥小體被激活，可放大肺部炎癥級聯(lián)反應[5]；創(chuàng)傷性腦損傷模型中，NLRP3炎癥小體會被激活[6]，同時阻斷自噬增強了 NLRP3炎癥小體通路的激活[7]。對自噬調控NLRP3炎癥小體在機械通氣致認知障礙中的作用值得探討，本研究擬評價機械通氣導致小鼠認知障礙時對自噬和NLRP3炎癥小體的影響，為明確其機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗分組與處理 SPF級健康雄性C57BL/6小鼠110只，8～12周齡，體質量20～25 g，由武漢大學動物實驗中心提供。110只小鼠采用隨機數字表法分為4組：對照組(C組，n=26)、機械通氣組(MV組，n=28)、機械通氣+雷帕霉素處理組(Rap組，n=28)、機械通氣+6-氨基-3-甲基嘌呤處理組(3-MA組，n=28)，MV組小鼠腹腔注射1%戊巴比妥0.05 mg/g麻醉后機械通氣6 h；Rap組和3-MA組小鼠在機械通氣前1 h分別給予0.001 mg/g自噬激動劑PaP和0.015 mg/g自噬抑制劑3-MA、再腹腔注射1%戊巴比妥0.05 mg/g麻醉后機械通氣6 h，C組小鼠腹腔注射等量1%戊巴比妥后自主呼吸6 h。

1.1.2主要試劑及儀器 TOPOTM動物呼吸機(美國Kent Scientific公司)，PhysioSuite動物血氧監(jiān)控儀(美國Kent Scientific公司)，22 G靜脈留置針(美國 B.Brun Melsungen公司)，雷帕霉素(美國Selleck公司)，6-氨基-3-甲基嘌呤(美國Selleck公司)，SuperMaze 曠場動物行為視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)，水迷宮動物行為視頻分析系統(tǒng)(上海吉良軟件科技公司)，倒置相差顯微鏡和普通正置顯微鏡(日本Olympus公司)；抗體、NLRP3一抗、凋亡相關微粒蛋白(advanced synthesis & catalysis，ASC)一抗和離子鈣接頭蛋白抗原(ionized calcium bindingadaptor molecule-1，IBA-1)一抗(美國abcam公司)、自噬相關蛋白p62一抗和微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)一抗(美國CST公司)、Caspase-1一抗(美國santa公司)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔二抗和異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)二抗(美國Aspen公司)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液(中國Aspen公司)，4%多聚甲醛緩沖液(碧云天生物有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1小鼠機械通氣模型的制備[8]腹腔注射1%戊巴比妥0.05 mg/g，待小鼠翻正反射消失，仰臥位固定，取頭高后肢低位，用鑷子將舌頭推向一側，然后用自制弧形壓舌板將舌頭向上提拉暴露聲門，同時，將照射燈垂直照射于頸部聲門處，22 G靜脈留置針插入氣管內，拔除針芯，確定雙肺通氣良好，膠布固定，連接TOPOTM動物呼吸機，采用壓力控制模式進行機械通氣，吸入氧濃度50%，通氣頻率130次/min，吸氣峰壓13～15 cmH2O(1 cmH2O=0. 098 kPa)，連接PhysioSuite動物血氧監(jiān)控儀測脈搏血氧飽和度和脈率。根據通氣情況，追加戊巴比妥維持麻醉，每2 h腹腔注射乳酸林格溶液0.1 mL；機械通氣6 h，氣管拔管后觀察無異常放回籠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2曠場實驗 于機械通氣結束后第1 和第3天，每組取8只小鼠，參照文獻[9]的方法行曠場實驗。曠場實驗分析箱為有機板制成白色無頂不透明的空箱(40 cm×40 cm×40 cm)，四壁涂黑，將其分為16(4×4)個大小均等的方格，中間的4個方格為中央區(qū)。實驗前，動物在測試房間適應10 min以上。實驗時，每只小鼠均從中間放入空箱中，允許其在箱中自由探索5 min，采用視頻監(jiān)測分析系統(tǒng)(SuperMaze 系統(tǒng)分析軟件)記錄運動總路程、中央區(qū)停留時間、跨格次數。實驗后用75%酒精擦拭實驗箱，以避免殘留氣味對后續(xù)實驗小鼠的影響。

1.2.3Morris水迷宮實驗 于機械通氣結束后第1 天，每組取8只小鼠，參照文獻[10]的方法行Morris水迷宮實驗。圓形水池直徑120 cm，高60 cm，平臺高50 cm，直徑10 cm，水池內注水使平臺低于水面1 cm，屏蔽劑為脫脂奶粉。水池分為4個象限，選擇其中一個象限作為目標象限并置入平臺，水池中心上方1.5 m處放置攝像機用于追蹤小鼠游泳路徑。水迷宮實驗共進行6 d，第1～5天為定向航行實驗：小鼠分別從水池4個對稱位置面向池壁入水，間隔20 min開始下一個象限，記錄每次入水到找到平臺的時間，若60 s內未找到平臺，則引導其找到平臺，并在平臺上停留15 s，時間記為60 s，取4次測試結果的平均值為逃避潛伏期；第6天為空間探索實驗：去除平臺，將小鼠頭朝池壁從原平臺象限對側緩慢放入水中，記錄60 s內運動軌跡，記錄目標象限停留時間，計算目標象限停留時間百分比。

1.2.4Western blot檢測 于機械通氣結束后第1和第3 天，每組取6只小鼠，戊巴比妥麻醉后斷頭冰上取腦，再分離雙側海馬組織，放入液氮保存。采用Western blot法檢測p62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、NLRP3、ASC、Caspase-1。取液氮凍存的海馬組織，加入相應體積裂解液，勻漿后離心，取上清，BCA法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品加入樣品孔中，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，分離蛋白質電轉印至PVDF膜，室溫下封閉液孵育1 h，分別加入內參GADPH抗體 (1 ∶10 000)、p62一抗 (1 ∶1 000)、LC3一抗(1 ∶1 000)、NLRP3一抗(1 ∶500)、Caspase-1一抗(1 ∶500)、ASC一抗(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次15 min，洗膜后加入HRP標記的山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育30 min，TBST室溫搖床洗4次，每次5 min，暗室內加入顯色發(fā)光液曝光、掃描。采用Image J軟件處理系統(tǒng)進行分析光密度值，并計算p62、NLRP3、Caspase-1、ASC與內參GADPH的比值和LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ表達的比值(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)，以反映目的蛋白的表達水平。

1.2.5免疫熒光檢測 于機械通氣結束后第1和第3 天，每組隨機取4只小鼠，戊巴比妥麻醉后固定，暴露心臟，將灌注裝置的針尖插入小鼠左心室，剪開右心耳，生理鹽水沖凈血液，然后用冰的4%多聚甲醛灌注小鼠，灌注成功標志為小鼠尾巴翹起，取小鼠海馬組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)冠狀面切片3張，片厚5 μm。石蠟切片置于65 ℃烘箱中烘片2 h，脫蠟復水后，置于EDTA緩沖液中微波修復。切片經PBS漂洗3次、每次5 min，正常山羊血清室溫封閉1 h，PBS漂洗后，加入一抗IBA-1抗體(1 ∶50)，4 ℃孵育過夜，加入相應的FITC標記的IgG二抗(1 ∶100)，室溫孵育50 min，PBS洗滌3次、每次5 min，DAPI染液室溫避光孵育5 min后PBS漂洗3次、每次5 min，抗熒光淬滅封片劑封片，在BX-51熒光顯微鏡下觀察、拍片。在海馬CAl區(qū)采集各指標免疫熒光圖像，并觀察細胞形態(tài)，離子鈣接頭蛋白-1(IBA-1)呈紅色熒光，采用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)計數IBA-1陽性細胞數，反映小膠質細胞的活化水平。每只小鼠隨機切取3張切片，每張切片3個視野。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 運動總路程、中央區(qū)停留時間及跨格次數

與C組比較，MV組小鼠各時點中央區(qū)停留時間延長，跨格次數減少(P<0.05)；與MV組比較，Rap組小鼠各時點中央區(qū)停留時間縮短，跨格次數增加(P<0.05)，3-MA組各時點中央區(qū)停留時間延長，跨格次數減少(P<0.05)。各組小鼠的運動總路程比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 四組小鼠機械通氣結束后各時點的曠場實驗結果Tab.1 Comparison of the results of the open field experiment at each time point after the mechanical ventilation of the four groups of

2.2 逃避潛伏期與目標象限停留時間百分比

與C組比較，MV組小鼠各時點逃避潛伏期延長，目標象限停留時間百分比降低(P<0.05)；與MV組比較，Rap組小鼠各時點逃避潛伏期縮短、目標象限停留時間百分比升高(P<0.05)，3-MA組小鼠各時點逃避潛伏期延長、目標象限停留時間百分比降低(P<0.05)。見表2和表3。

表2 四組小鼠機械通氣結束后第1天逃避潛伏期和目標象限停留時間百分比Tab.2 Comparison of the 1st day escape latency and the percentage of stay time in the target quadrant after the end of mechanical ventilation in the four groups of

表3 四組小鼠機械通氣結束后第3天逃避潛伏期和目標象限停留時間百分比的比較Tab.3 Comparison of the 3rd day escape latency and the percentage of stay time in the target quadrant after the end of mechanical ventilation in the four groups of

2.3 海馬組織自噬相關蛋白p62和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達

與C組比較，MV組小鼠各時點海馬組織p62表達降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達增加(P<0.05)；與MV組比較，Rap組小鼠各時點海馬組織p62表達增加、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達降低(P<0.05)，3-MA組小鼠各時點海馬組織p62表達降低、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達增加(P<0.05)。見圖1。

2.4 海馬 NLRP3、ASC、Caspase-1的表達

與C組比較，MV組小鼠各時點海馬組織NLRP3、ASC、Caspase-1表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與MV組比較，Rap組小鼠各時點海馬組織NLRP3、ASC、Caspase-1表達降低，3-MA組各時點海馬組織NLRP3、ASC、Caspase-1表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。圖2。

2.5 海馬小膠質細胞IBA-1的表達

與C組比較，MV組小鼠各時點小膠質細胞標記物IBA-1陽性細胞數增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與MV組比較，Rap組小鼠各時點海馬小膠質細胞標記物IBA-1陽性細胞數減少，3-MA組小鼠各時點小膠質細胞標記物IBA-1陽性細胞數增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

機械通氣是一種至關重要的生命支持工具，但它也可能對肺、膈肌和大腦等遠端器官造成損傷，有證據表明機械通氣是腦損傷的促成因素，通過誘發(fā)全身炎癥或改變與神經炎癥和神經元死亡相關的迷走神經信號導致認知障礙[11]。自噬與炎癥反應密切相關，自噬可負向調控NLRP3炎癥小體的激活，應用自噬激動劑雷帕霉素可促進自噬誘導，增加NLRP3炎癥小體降解[12]。有研究提出在小鼠動物實驗中330 min為長時間機械通氣[13]，也有研究表明90 min高氣道壓機械通氣就可通過迷走多巴胺通過發(fā)揮作用引起海馬凋亡發(fā)生率增加[13]。前期研究證實，小鼠機械通氣6 h，可引起海馬神經元凋亡，導致早期學習記憶功能下降[14]，因此本研究選擇機械通氣時間為6 h。術后長期機械通氣的患者急性腦功能障礙通常發(fā)生在機械通氣結束后1～3 d[15]，因此本研究在機械通氣后第1和第3天評價海馬炎癥反應。參照文獻[16-17]選擇3-MA的劑量為0.015 mg/g，RaP的劑量為0.001 mg/g，于機械通氣前1 h腹腔注射。

曠場實驗用于評價動物自主行為、探索行為及緊張度[18]，主要觀察動物在開闊環(huán)境中的行為學變化。Morris水迷宮實驗作為評價齲齒類動物空間學習記憶的經典方法，主要包括定向航行實驗和空間探索實驗[19]。本研究結果顯示，小鼠機械通氣6 h后中央區(qū)停留時間延長，跨格次數減少，運動總路程差異無統(tǒng)計學意義，提示小鼠探索行為減少，對新環(huán)境認知能力降低，但運動能力無明顯變化；逃避潛伏期延長，目標象限停留時間百分比降低，提示小鼠海馬相關記憶功能減退。以上結果表明，機械通氣小鼠認知障礙模型制備成功。與MV組比較，Rap組各時點中央區(qū)停留時間縮短，跨格次數增加，逃避潛伏期縮短，目標象限停留時間百分比升高；3-MA組各時點中央區(qū)停留時間延長，跨格次數減少，逃避潛伏期延長，目標象限停留時間百分比降低，提示自噬激動劑RaP減輕了機械通氣導致的腦損傷，自噬抑制劑3-MA加重了機械通氣導致的腦損傷。

機械通氣時導致的神經認知障礙主要是基于肺腦交互機制，外周(肺)與中樞神經系統(tǒng)(CNS)之間通過體液、神經和細胞這3條途徑進行溝通。體液途徑即在肺中募集的單核細胞或巨噬細胞增加了炎癥介質如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6、IL-1β，這些介質可以通過體液途徑室周器官(OCV)直接到達中樞神經系統(tǒng)，而無需穿過血腦屏障(BBB)，還有其他主動運輸機制會在大腦水平產生前列腺素E2(PGE2)和一氧化氮；神經途徑即迷走神經通路的傳入通過孤束核(NTS)到達大腦；細胞途徑即由肺中的TNF-α直接調節(jié)，這會刺激大腦水平的單核細胞-1(MCP-1)的釋放，反過來又能夠增加CNS和外周激活單核細胞的募集[20]。NLRP3炎癥小體是由NLRP3、ASC和Caspase-1組成，是系列炎癥反應的核心。NLRP3炎癥小體的降解可抑制小膠質細胞的炎癥反應，減少炎性介質的分泌，在神經退行性病變中發(fā)揮作用[21]。有研究表明，大潮氣量機械通氣急性期促發(fā)肺部異常自噬活躍，自噬標志物LC3-Ⅱ表達過度上調，肺泡巨噬細胞形成自噬小體增多，激活NLRP3炎癥小體，導致肺組織病理損傷增加，IL-1β等炎癥介質表達增加[16]。有研究表明，慢性腦缺血損傷誘導小膠質細胞過度激活，阻斷自噬可能有助于激活NLRP3炎癥小體，進一步加劇神經炎癥的發(fā)生[7]。在阿爾茨海默病中，小膠質細胞的自噬激活可降解和清除細胞外β-樣淀粉蛋白，并調節(jié)β-淀粉樣蛋白誘導的NLRP3炎癥小體激活[22]。本研究中，與C組相比，MV組各時點海馬組織p62表達降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、NLRP3、ASC、Caspase-1表達增加，提示機械通氣可能通過激活NLRP3炎癥小體導致小鼠的神經認知障礙。與MV組相比，Rap組各時點海馬組織p62表達增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、NLRP3、ASC、Caspase-1表達降低；3-MA組各時點海馬組織p62表達降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、NLRP3、ASC、Caspase-1表達增加，提示RaP通過增強自噬減輕了機械通氣導致的炎癥反應，3-MA通過抑制自噬加重了這種炎癥反應。

IBA-1在神經系統(tǒng)特異表達在小膠質細胞表面，激活小膠質細胞可大幅上調IBA-1表達。小膠質細胞激活是神經炎癥的標志，持續(xù)的小膠質細胞激活可能會促進NLRP3炎癥小體的過度激活[23]。研究表明，外周炎癥刺激激活腦內小膠質細胞活化參與膿毒癥所致譫妄[24]。本課題組前期研究證實，MV激活海馬小膠質細胞、引起凋亡級聯(lián)通路，導致認知功能障礙[25]。本研究中，與C組比較，MV組各時點海馬小膠質細胞IBA-1陽性細胞數增加；與MV組比較，Rap組各時點海馬小膠質細胞IBA-1陽性細胞數減少，3-MA組各時點小膠質細胞IBA-1陽性細胞數增加，提示機械通氣過程中自噬增加、NLRP3炎癥小體激活可能與小膠質細胞的激活有關。

綜上所述，機械通氣可導致小鼠神經認知功能障礙，NLRP3炎癥小體介導了機械通氣相關性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展過程，可能與自噬水平減弱及NLRP3炎癥小體激活有關。增強自噬可通過增加NLRP3炎癥小體的降解來減輕這種炎癥反應，從而改善認知障礙。