幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白不同片段對胃癌細(xì)胞γH2AX表達(dá)的影響*

賈岑岑， 王琴容， 周建獎， 程薇， 趙艷，**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室 & 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科， 貴州 貴陽 550004)

胃癌是全球范圍內(nèi)常見的消化道腫瘤，發(fā)病率和死亡率分別排在所有腫瘤第5位和第3位，在中國胃癌發(fā)病率居第3 位[1]。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)在胃炎、消化性潰瘍和胃癌的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，被認(rèn)為是胃癌的致病菌，其表達(dá)的細(xì)胞毒素相關(guān)基因A (cytotoxin-associated gene A, CagA) 蛋白和空泡毒素A(vacuolating cytotoxin A，VacA)是H.pylori致病的關(guān)鍵因素[2-3]。CagA通過細(xì)菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)進(jìn)入胃上皮細(xì)胞，其C端有5個氨基酸組成的基序，即谷氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-酪氨酸-丙氨酸(glu-pro-lle-tyr-ala ，EPIYA)基序。宿主細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶使EPIYA基序中酪氨酸磷酸化，與相鄰序列一起產(chǎn)生CagA的生物活性[4]。CagA蛋白有EPIYA-A、EPIYA-B、EPIYA-C及EPIYA-D 4種不同的EPIYA基序，從西方國家分離的菌株通常具有EPIYA-A、EPIYA-B和EPIYA-C，稱西方型CagA；而東亞國家的菌株具有EPIYA-A、EPIYA-B和EPIYA-D序列，稱東亞型CagA[5-6]；在亞洲國家的東方型CagA比西方型CagA引起胃癌發(fā)生的風(fēng)險更高[7]。有研究顯示，CagA陽性菌株的感染會增加胃黏膜的炎癥，引發(fā)氧化應(yīng)激和DNA損傷，從而增加宿主細(xì)胞中基因組不穩(wěn)定，增強(qiáng)胃癌發(fā)生的風(fēng)險[8-10]。DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSBs)是DNA損傷的一種特征類型，磷酸化組蛋白H2AX (histone protein H2AX，γH2AX)是由DSB斷點處的組蛋白H2AX磷酸化而來，γH2AX參與DNA損傷應(yīng)答過程，是目前最常用的 DSBs 損傷評價的指標(biāo)，因而用特異性抗體標(biāo)記γH2AX后、可通過熒光顯微鏡觀察焦點的多少來判斷DNA雙鏈斷裂的多少，從而判斷DNA損傷[11-12]。本研究選取課題組前期分離的H.pylori東亞株，構(gòu)建不同序列的CagA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分析不同序列的CagA對胃癌細(xì)胞DNA損傷的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細(xì)胞株及H.pylori胃癌AGS細(xì)胞株購于美國ATCC公司，H.pyloriGZ7ΔCagA(CagA敲除株)由課題組前期構(gòu)建，H.pyloriGZ7(野生株)由課題組分離、鑒定和保存，其CagA序列已上傳GenBank數(shù)據(jù)庫 (KR154737)，鑒定為典型東亞株。

1.1.2主要試劑及儀器 無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒(天根生化科技有限公司)，Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)，伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清及胰酶(美國Gibco公司)，兔抗 γH2AX抗體 (1 ∶200,proteintech)、熒光二抗 (1 ∶200，proteintech)及pcDNA3.1(PC)質(zhì)粒(上海生物生工公司)；微需氧產(chǎn)氣袋及密封罐(日本三菱公司)，流式細(xì)胞分析儀(美國BD Medical Technology公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)菌質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及測序鑒定 本課題組前期構(gòu)建并保存的各種H.pyloriGZ7-CagA表達(dá)載體分為載體a、載體b、載體c、載體d和載體e，將5種不同質(zhì)粒分別置于感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，冰上30 min，42 ℃水浴中熱激90 s，置于冰上；加Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基500 μL，2 000 r/min于37 ℃空氣震蕩1 h，涂布于50 mg/L Ampicillin的LB培養(yǎng)板上，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取陽性單克隆菌落，于含Ampicillin的液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)；用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后進(jìn)行測序鑒定。見圖1。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 人胃癌細(xì)胞AGS用含10 %胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)；取對數(shù)生長期的人胃癌細(xì)胞以4×105個/孔細(xì)胞量接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞融合度至60%時，設(shè)PC組及載體a、載體b、載體c、載體d、載體e組，分別用PC質(zhì)粒和載體a、b、c、d、e以質(zhì)粒 ∶Lipofectamine2000為3 ∶5的比例分別轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，6 h后更換培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞備用。

1.2.3H.pylori的培養(yǎng)及細(xì)胞感染H.pyloriGZ7和H.pyloriGZ7ΔCagA接種于哥倫比亞血瓊脂平板并放置于密封罐中，加微需氧產(chǎn)氣袋(7%氧氣、10%CO2、83%氮)37 ℃培養(yǎng)3 d ；取對數(shù)期生長的胃癌細(xì)胞接種于6孔板，按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI；細(xì)菌 ∶細(xì)胞) 30 ∶1加H.pyloriGZ7和H.pyloriGZ7ΔCagA感染細(xì)胞，分為Control組、H.pyloriGZ7組和H.pyloriGZ7ΔCagA組，感染6 h后換液。

1.2.4免疫熒光檢測γH2AX 將對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞AGS接種于已放有玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別用不同的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline， PBS)洗滌，加0.3%Triton-X 100通透細(xì)胞30 min，PBS洗滌3次、5 min/次；5%牛血清蛋白封閉液封閉1 h；加兔抗γH2AX抗體(1 ∶200)4 ℃過夜；PBS洗滌，加羊抗兔的熒光二抗(1 ∶200)室溫1 h；PBS洗滌3次、5 min/次，加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)溶液避光孵育10 min；PBS洗滌3次，滴加適量的抗熒光猝滅劑，熒光顯微鏡觀察采圖。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 分別收集各種載體轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次；加預(yù)冷的PBS制備的70%乙醇，吹打混勻，4 ℃過夜；1 000 r/min離心5 min，去除乙醇，PBS洗滌細(xì)胞1次，加碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液500 (L于4℃避光孵育30 min，尼龍布過濾樣本，流式細(xì)胞儀分析樣本。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 載體鑒定

復(fù)蘇本課題組保存的5個不同片段的CagA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，測序驗證，用Snapgene 6.0進(jìn)行序列比對(圖2)，提示所有的載體構(gòu)建成功。

2.2 H. pylori GZ7和H. pylori GZ7ΔCagA感染對胃癌細(xì)胞DNA損傷的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，H.pyloriGZ7感染的胃癌細(xì)胞AGS核內(nèi)γH2AX的表達(dá)高于H.pyloriGZ7ΔCagA感染的細(xì)胞(P<0.05 )，提示H.pylori注入細(xì)胞的CagA是引起細(xì)胞DNA損傷的主要因素。見圖3。

2.3 不同序列的CagA載體轉(zhuǎn)染對胃癌細(xì)胞γH2AX表達(dá)的影響

將不同序列的CagA載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞AGS，用免疫熒光檢測γH2AX的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與PC組比較，載體a、載體b、載體c、載體d和載體 e轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞AGS細(xì)胞核內(nèi)γH2AX的表達(dá)均有增加(P<0.05或P<0.01)，其中載體b、載體c和載體d表達(dá)增加更明顯(P<0.01)，提示CagA中的EPYIA序列是引起細(xì)胞DNA損傷的主要結(jié)構(gòu)。見圖4。

2.4 不同序列的CagA載體對細(xì)胞周期分布的影響

不同載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞AGS后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，結(jié)果表明，載體 a和載體 c轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞AGS的G0/G1期細(xì)胞比例升高(P<0.05)，載體 b、載體 c、載體d及載體e轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞AGS的G2/M期比例明顯升高(P<0.01)。見圖5。

3 討論

超過60%的胃癌是由H.pylori感染引起，被歸類為I類致癌物，是導(dǎo)致慢性胃炎、消化性潰瘍和胃腺癌等嚴(yán)重胃疾病中已知最強(qiáng)的風(fēng)險因素[13]。它含有多種黏附素，介導(dǎo)細(xì)菌與胃上皮細(xì)胞的緊密粘附，從而啟動和促進(jìn)細(xì)菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)的形成[14-16]。CagA通過細(xì)菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)進(jìn)入胃上皮細(xì)胞，其C端的EPIYA基序被宿主細(xì)胞內(nèi)c-Src和c-Abl家族的酪氨酸激酶依次磷酸化，磷酸化后的酪氨酸與Src同源2磷酸酶[Src homology 2(SH2)-containing protein-tyrosine phosphatase，SHP2]或適配蛋白(growth factor receptor-bound protein 2，GrB2)相互作用，從而激活一系列相關(guān)通路，抑制細(xì)胞的增殖并阻礙細(xì)胞間的粘附[17]。

DNA損傷是DNA在復(fù)制過程中核苷酸序列發(fā)生永久性改變，從而導(dǎo)致遺傳特征發(fā)生改變。受損的DNA復(fù)制可能導(dǎo)致基因突變，癌基因、抑癌基因或控制細(xì)胞周期的基因突變可以產(chǎn)生在增殖方面具有明顯優(yōu)勢細(xì)胞群，這一系列改變是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制。DSBs是最嚴(yán)重的DNA損傷類型之一，是DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中2條互補鏈于同一對應(yīng)處或緊密相鄰處同時斷裂的DNA損傷，斷裂處可誘導(dǎo)組蛋白H2AX保守區(qū)139位絲氨酸磷酸化形成γH2AX，進(jìn)而募集DNA修復(fù)蛋白完成DNA的損傷修復(fù)，是細(xì)胞發(fā)生雙鏈DNA斷裂的特征性標(biāo)志。有研究報道，細(xì)胞發(fā)生DSBs后1～3 min即有γH2AX出現(xiàn)在DSBs處，顯微鏡下在細(xì)胞核中可見特征性的點狀結(jié)構(gòu)(foci)，10 min時達(dá)到最高，因而用來評價DSBs的程度[18]。體外研究表明，H.pylori通過誘導(dǎo)DSBs并抑制胃上皮細(xì)胞中多種DNA修復(fù)基因的功能，是通過調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)反應(yīng)而導(dǎo)致胃癌發(fā)生的關(guān)鍵因素[19-20]，但其潛在機(jī)制尚未完全清楚。H.pylori可通過多種方式引起細(xì)胞DNA損傷：(1)H.pylori持續(xù)感染引起細(xì)胞中活性氧增加，引起DNA損傷[21]；(2)H.pylori通過細(xì)菌IV型分泌系統(tǒng)激活NF-κB，使核苷酸內(nèi)切酶XPF和XPG富集，引起DNA損傷[22]；(3)CagA已被證明可與PAR1、MARK相互作用，導(dǎo)致DSBs增加和染色體不穩(wěn)定[23-24]；(4)H.pylori感染被報道會誘發(fā)微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)以及移碼和點突變[25-29]。 然而這些研究結(jié)果主要是基于H.pylori西方株獲得的。

γH2AX是細(xì)胞DNA損傷后修復(fù)的特征性標(biāo)志，通常用于判斷細(xì)胞DNA損傷。本研究利用課題組前期分離的CagA+H.pylori東亞株，首先證實H.pylori野生株比CagA敲除株引起γH2AX表達(dá)更高，提示CagA是引起細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷的主要因素；隨后構(gòu)建了CagA不同區(qū)域的表達(dá)載體，5個載體轉(zhuǎn)染后，所有胃癌細(xì)胞的S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均降低，提示不同序列的CagA載體均能抑制細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)含有完整EPYIA基序的CagA(載體b、c及d)是引起細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷的重要結(jié)構(gòu)，而去除EPYIA基序后，CagA(載體a和e)使細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷明顯降低。細(xì)胞DNA損傷后會阻斷細(xì)胞周期的進(jìn)程，使細(xì)胞阻滯于G0/G1期或G2/M期，讓細(xì)胞進(jìn)行DNA的修復(fù)反應(yīng)。DSBs主要啟動2種類型的修復(fù)途徑——同源重組和非同源末端連接，前者主要發(fā)生于晚S期和G2期，后者則發(fā)生G1期和早S期[30]。本研究結(jié)果表明，所有的CagA載體(包括去除EPYIA基序的載體a和載體e)均能抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，其中載體b、c、d及e可使細(xì)胞阻滯于G2/M期，載體a則使細(xì)胞主要阻滯于G0/G1。進(jìn)一步提示CagA能引起細(xì)胞的DNA損傷，尤其是攜帶EPYIA基序的CagA主要引起DSBs并以DNA的同源修復(fù)為主，同時顯示除了DSBs以外，CagA還能引起其它類型的DNA損傷。

綜上，本研究結(jié)果表明CagA是H.pylori感染誘導(dǎo)細(xì)胞DSBs的重要因素，而CagA中的EPYIA基序是其損傷的重要結(jié)構(gòu)，從而為H.pylori-CagA在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要線索。