CD133+與CD133-人原代胃癌細(xì)胞的差異表達(dá)基因及核心基因的篩選*

賈岑岑， 程薇， 李雷蕾， 曾曉燕， 廖永慧， 謝淵， 周建獎， 趙艷

(貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004)

胃癌是全球第5大常見癌癥，亦是死亡率第4位的惡性腫瘤[1]。目前，胃癌具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，其發(fā)生發(fā)展是多種因素綜合的結(jié)果，包括幽門螺桿菌感染、遺傳因素、飲食習(xí)慣、飲酒以及吸煙等[2-4]。隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識和研究不斷深入，腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)學(xué)說對探索新的腫瘤治療方式具有重要意義[5]。目前已知的大多數(shù) CSC 表面標(biāo)記都來自已知的胚胎或成人干細(xì)胞表面標(biāo)記，以此來識別癌癥組織中CSC[6]。CD133是具有5次跨膜結(jié)構(gòu)的糖蛋白，也是近年來研究較多的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物。有研究顯示，CD133在胃癌中的過度表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、化學(xué)耐受性以及血管浸潤相關(guān)，且患者的預(yù)后較差[7-11]。CD133在胰腺癌、肺癌、肝癌、腦腫瘤等多種腫瘤組織中均有表達(dá)[12-15]，且與消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。為了研究CD133陽性胃癌干細(xì)胞中的關(guān)鍵基因與通路，本研究利用前期分選出的CD133+與CD133-原代胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，應(yīng)用生物信息學(xué)分析兩者之間的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)，結(jié)合Cytoscape 3.8.0、GEPIA、ULCAN和Metascape構(gòu)建基因的蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)基因和相關(guān)通路，旨在探索參與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的潛在核心基因，為CD133+胃癌干細(xì)胞與胃癌的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療及預(yù)后提供新的研究線索。

1 材料與方法

1.1 材料、主要試劑及儀器

CD133+與CD133-人原代胃癌細(xì)胞由課題組前期分選鑒定，保存于液氮罐中；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、雙抗、胰蛋白酶購于美國Gibco公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司，超凈工作臺購于蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1數(shù)據(jù)收集及DEGs篩選 課題組前期通過華大基因科技有限公司對CD133+與CD133-人原代胃癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，本次研究通過R語言(4.0.4版本)Affy程序包對轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾和標(biāo)準(zhǔn)化處理，再運(yùn)用limma安裝包篩選得到DEGs，以|log2FC|≥1和P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對DEGs繪制火山圖和聚類熱圖，直觀地展示基因表達(dá)情況。

1.2.2基因本體論(gene ontology, GO)和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫 (Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析 利用生物信息注釋數(shù)據(jù)庫Metascape (http://metascape.org/),以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選DEGs的GO富集結(jié)果和KEGG信號通路分析結(jié)果。GO功能富集包含生物過程(biological process, BP)、細(xì)胞組成(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)3個(gè)方面。

1.2.3蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心基因的篩選 應(yīng)用在線數(shù)據(jù)庫STRING(http//string-db.org/)，以medium confidence>0. 4為條件來構(gòu)建CD133+與CD133-人原代胃癌細(xì)胞DEGs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape3.8.2軟件(http://www.cytoscape.org/)將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，利用CytoHubba插件計(jì)算各節(jié)點(diǎn)間的數(shù)值，并使用MCODE插件從PPI網(wǎng)絡(luò)中選取最重要的模塊進(jìn)行分析，篩選出核心基因。

1.2.4核心基因與臨床患者總生存率的關(guān)系分析 利用腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA) 數(shù)據(jù)庫，通過在線網(wǎng)站Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/)分析核心基因與臨床胃癌患者總生存率的關(guān)系，篩選條件：(1)癌癥，胃癌; (2)基因，見表1；(3)生存期，總生存期；(4)閾值，All; (5)患者，自動選擇最佳。評估核心基因在預(yù)測胃癌患者預(yù)后中的價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 DEGs的篩選

經(jīng)R語言limma安裝包分析，按照|log2FC|≥1，P<0.05為篩選閾值，在CD133+和CD133-人原代胃癌細(xì)胞中共篩選出305個(gè)DEGs，其中在CD133+細(xì)胞中下調(diào)的DEGs 227個(gè)，上調(diào)的DEGs 78個(gè)。見圖1。

2.2 GO富集與KEGG通路富集

GO富集以P<0.01，以最小重疊基因=3和最小富集因子>1.5作為閾值，分別對78個(gè)上調(diào)DEGs和227個(gè)下調(diào)DEGs進(jìn)行分析，圖2結(jié)果顯示：上調(diào)的DEGs主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附、rho蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)的生物過程、鈣離子通道調(diào)節(jié)以及鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性調(diào)節(jié)等分子功能；下調(diào)的DEGs主要參與DNA復(fù)制、DNA代謝、ncRNA代謝的生物過程、甲基轉(zhuǎn)移酶活性、單鏈DNA螺旋酶活性以及乙酰轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能。KEGG通路富集發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集于IL-17信號通路、破骨細(xì)胞的分化、RNA運(yùn)輸以及MAPK信號通路等。見圖3。

2.3 PPI構(gòu)建與核心基因的篩選

PPI圖中共有187個(gè)節(jié)點(diǎn)，連接線362個(gè)，見圖4。應(yīng)用CytoHubba插件計(jì)算各節(jié)點(diǎn)間的數(shù)值，MCODE插件分析PPI網(wǎng)絡(luò)中連接最緊密的基因模塊，從中選取分?jǐn)?shù)排名前3的模塊，見圖5；根據(jù)度值評分篩選出前20的基因即核心基因，見表1。

2.4 核心基因與胃癌患者總生存率分析

分析20個(gè)核心基因與臨床胃癌患者總生存率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)趨化因子8(C-X-Cmotifchemokine8,CXCL8)(HR=0.65)、TCP1伴侶蛋白亞基2(chaperonincontainingTCP1,subunitβ,CCT2) (HR=0.76)、核糖體產(chǎn)物因子 2(ribosomeproductionfactor2，RPF2)(HR=0.77)、蛋白酶體 20S 亞基α4(proteasome20Ssubunitalpha4，PSMA4)(HR=0.56)、胞質(zhì)伴侶素6A(chaperonincontainingTCP1subunit6A，CCT6A)(HR=0.74)、蛋白酶體 26S 亞基(proteasome26Ssubunit,non-ATPase12，PSMD12)(HR=0.63)以及凝聚素Ⅰ復(fù)合物亞基G(non-SMCcondensinIcomplexsubunitG，NCAPG)(HR=0.63)基因表達(dá)與總生存率負(fù)相關(guān)(P<0.05)；RUNX 家族轉(zhuǎn)錄因子2(RUNXfamilytranscriptionfactor2，RUNX2)(HR=1.51)與總生存率正相關(guān)(P<0.05)。圖6。

表1 PPI網(wǎng)絡(luò)中前20的核心基因Tab.1 Top 20 core genes in the PPI network

3 討論

胃癌仍然是全球癌癥死亡的重要原因，死亡率很高。CSC是具有干細(xì)胞特征的癌細(xì)胞，占整個(gè)腫瘤的極少部分，它們具有自我更新和分化能力，被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的起源。研究表明，CD133作為CSC標(biāo)志物可以在多種實(shí)體瘤中調(diào)節(jié)細(xì)胞自我更新和腫瘤發(fā)生。因此，進(jìn)一步基于CD133尋找針對胃癌新的分子標(biāo)記物，了解胃癌的發(fā)展進(jìn)程和分子機(jī)制對于胃癌患者的治療和預(yù)后至關(guān)重要。

本研究基于課題組前期分選出的CD133+與CD133-人原代胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，篩選出CD133+與CD133-原代胃癌細(xì)胞之間的DEGs 305個(gè)，其中表達(dá)下調(diào)的DEGs 227個(gè)，上調(diào)的DEGs 78個(gè)。GO功能富集分析顯示DEGs主要參與鈣離子通道調(diào)節(jié)、DNA的復(fù)制以及DNA的代謝過程等；KEGG通路富集提示DEGs主要富集于IL-17信號通路、RNA運(yùn)輸以及MAPK信號通路；基于Metascape的GO分析工具，上調(diào)的DEGs與信號傳導(dǎo)受體活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞粘附以及rho蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)、鈣離子通道調(diào)節(jié)及鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性有關(guān)。下調(diào)DEGs主要在DNA復(fù)制、DNA的代謝過程、ncRNA代謝、甲基轉(zhuǎn)移酶活性、單鏈DNA螺旋酶活性和乙酰轉(zhuǎn)移酶活性以及細(xì)胞內(nèi)的蛋白絡(luò)合物富集。通過構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，并篩選出20個(gè)核心基因，其中CCT2、CCT6A、RPF2、PSMA4、PSMD12、NCAPG和RUNX2與胃癌患者的預(yù)后相關(guān)，以上8個(gè)關(guān)鍵基因中除RUNX2在CD133+中上調(diào)與總生存率正相關(guān)，其余七個(gè)基因在CD133+中皆表達(dá)下調(diào)，且表達(dá)與總生存率負(fù)相關(guān)，提示以上基因與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。

CCT參與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)折疊，調(diào)節(jié)許多腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)和細(xì)胞周期,每個(gè)環(huán)有8個(gè)不同的亞基構(gòu)成，其中 CCT2是CCT的β亞基。既往研究發(fā)現(xiàn)CCT2在乳腺癌、膽囊癌、腸癌及肝癌中高表達(dá)，且CCT2的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后密切相關(guān)[20-21]，CCT2在幫助折疊作用素、管蛋白和其他細(xì)胞溶性蛋白方面起關(guān)鍵作用[22-23]。CCT6A則是CCT的第六個(gè)亞基的a亞型，CCT6A被發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)幾種癌癥的進(jìn)展中起重要的作用[24]。 CCT6A能促進(jìn)非小細(xì)胞癌細(xì)胞生存和轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期[25-26]。目前CCT2、CCT6A與胃癌之間的研究較少。RNA結(jié)合蛋白在rRNA處理和防止錯(cuò)誤折疊rRNA的形成方面起重要作用。RPF2是一個(gè)RNA結(jié)合蛋白，它能與核糖體合成調(diào)控因子1相互作用后影響60S核糖體亞單位的生物合成[27]。目前尚未見RPF2在腫瘤中的研究。PSMA4 是20S蛋白酶核心的α亞基，控制蛋白酶體的活性。已有研究表明PSMA4的缺失會降低蛋白酶體的活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的積累，影響轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期進(jìn)展以及凋亡中涉及的蛋白質(zhì)的降解。因此，若PSMA4缺失則會導(dǎo)致蛋白酶體功能障礙對細(xì)胞造成壓力[28]。肺癌中PSMA4在癌細(xì)胞增殖起著重要的作用，下調(diào)會誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡[29]，但其在胃癌和其他腫瘤中的作用尚未涉及。PSMD12則是26S蛋白酶復(fù)合物的19S調(diào)節(jié)因子的非ATPase亞基，可以去除錯(cuò)誤折疊或受損的蛋白質(zhì)來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)和凋亡。PSMD12在多種腫瘤中高表達(dá)并能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其在乳腺癌中能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長和遷移并抑制凋亡[30]；在膠質(zhì)瘤中被認(rèn)為是腫瘤發(fā)展和進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，可作為治療膠質(zhì)瘤的潛在生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)[31]。目前PSMD12在胃癌中的研究尚未見報(bào)道。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 (RUNX) 蛋白屬于轉(zhuǎn)錄因子家族，被稱為重要胚胎發(fā)育程序的主要調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞凋亡[32]。在哺乳動物中RUNX家族有3個(gè)成員，分別是RUNX1、RUNX2和RUNX3，其中RUNX2對成骨至關(guān)重要[33]。既往研究發(fā)現(xiàn)RUNX2在乳腺癌[34]、肺癌[35]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[36]、結(jié)直腸癌[37]等多種腫瘤中過度表達(dá)并提示預(yù)后不良。越來越多的證據(jù)表明 RUNX2在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。RUNX2參與了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，與胃癌臨床病理參數(shù)和患者的預(yù)后密切相關(guān)[38]。

綜上所述, 本研究利用生物信息學(xué)篩選出CD133+與CD133-人原代胃癌細(xì)胞之間的305個(gè)DEGs，成功構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出可能參與胃癌發(fā)生的20個(gè)關(guān)鍵基因，其中CCT2、RPF2、PSMA4、CCT6A、PSMD12、NCAPG和RUNX2與胃癌的預(yù)后相關(guān)。本研究將為胃癌干細(xì)胞的分子機(jī)制及胃癌治療提供新的靶點(diǎn)。