基于膜電位檢測原理的 γ-氨基丁酸A型受體藥物高通量篩選模型

張 毅，石 童，張瑞華，陳學(xué)軍，靳 倩，石晶晶，王 陳，李麗琴

（國民核生化災(zāi)害防護國家重點實驗室，北京 102205）

γ-氨基丁酸A型受體（γ-aminobutyric acid type A receptor，GABAAR）是由5種亞基組成的配體門控氯離子通道受體，其中α1β2γ2亞型組成在人體內(nèi)分布最廣［1］。GABAAR因為其多樣的藥理學(xué)功能被廣泛關(guān)注，激動劑GABA通過抑制興奮發(fā)生和傳遞，介導(dǎo)鎮(zhèn)靜睡眠、抗驚厥和抗焦慮等相關(guān)生理過程［2-3］，陽性變構(gòu)劑地西泮（diazepam，Dia）通過對GABAAR的變構(gòu)作用增強GABA對GABAAR的激動作用［4-5］。因此，GABAAR作為抗焦慮和鎮(zhèn)靜睡眠藥物作用的主要靶點，在睡眠發(fā)生和維持等睡眠相關(guān)過程中發(fā)揮重要功能。

體外基于GABAAR的促睡眠藥物篩選方法主要有標記法和非標記法，其中非標記法主要有膜片鉗電生理檢測法、Cl-敏感熒光染料檢測法和膜電位檢測法。膜片鉗電生理檢測法存在對細胞有損傷作用、檢測通量小、成本高昂的問題；Cl-敏感熒光染料檢測法存在易漂白、檢測時限短的問題［6］。近年來發(fā)展的基于膜電位檢測原理的實時熒光信號檢測技術(shù)，其檢測原理為：當激動劑GABA作用于GABAAR時，引起Cl-內(nèi)流進入細胞膜，膜內(nèi)側(cè)呈負電性，細胞表現(xiàn)為超極化狀態(tài)，這種超極化狀態(tài)很快被細胞外的陽離子進入膜內(nèi)側(cè)而削弱。本研究中使用的膜電位敏感熒光染料具有陽離子親和性，在陽離子進入膜內(nèi)側(cè)的同時，熒光染料也隨陽離子一起進入細胞膜內(nèi)，表現(xiàn)為熒光信號增強，熒光信號的大小與激動劑GABA劑量相關(guān)。因此，激動劑GABA引起的Cl-內(nèi)流表現(xiàn)為較高的熒光信號，反之，表現(xiàn)為較低的熒光信號。該技術(shù)已經(jīng)在Na+和K+通道藥物篩選中獲得應(yīng)用［7-8］，但是在Cl-通道藥物篩選中尚未得到廣泛應(yīng)用。隨著熒光信號檢測儀器靈敏度和檢測通量的提高，基于膜電位檢測原理的高通量藥物篩選方法顯示出良好的應(yīng)用前景。

本研究擬應(yīng)用表達人源α1β2γ2L亞型的GABAAR-CHO細胞株建立基于膜電位檢測原理的藥物高通量篩選方法，并通過方法優(yōu)化、工具化合物精密度檢測、工具化合物劑量-效應(yīng)關(guān)系檢測等進行方法考察，為靶向GABAAR的活性化合物的早期發(fā)現(xiàn)提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和主要儀器

表達人源α1β2γ2L亞型的GABAAR-CHO細胞株（α1亞基誘導(dǎo)表達，由本課題組構(gòu)建并保存）；紅色染料、藍色染料和Tetra型實時熒光定量分析系統(tǒng)（美國Molecular Devices公司）；GABA（批號：APN15178-1-1，英國Abcam公司）；Dia（批號：171225-200903，中國藥品生物制品檢定研究所）；加巴嗪（gabazine，Gab，批號：G215SM0150，美國Alomone公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Gibco公司）；Hank′s液（上海吉至生化有限公司）；384孔細胞檢測板和384孔化合物板（德國Greiner公司）；其他試劑均為上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品。Countstar BioTech型細胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；B3111型CO2培養(yǎng)箱和1384型超凈工作臺（美國Thermo公司）；IX51型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Five Easy型pH檢測儀（瑞士Mettler Toledo公司）；萬分之一電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 GABAAR藥物高通量篩選反應(yīng)體系構(gòu)建

將細胞在DMEM/F12混合培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、殺稻瘟菌素10 mg·L-1、選擇性抗生素博來霉素100 mg·L-1、嘌羅霉素1 mg·L-1和潮霉素B 300 mg·L-1。將細胞置于37℃含5% CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2 d按照1∶8～1∶10的比例傳代。

基于膜電位檢測原理構(gòu)建藥物高通量篩選方法的反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系包含貼壁完全的細胞、膜電位敏感染料、激動劑激活受體濃度和反應(yīng)緩沖液。首先，當細胞生長密度達到80%時，在GABAAR-CHO細胞中加入四環(huán)素1 mg·L-1誘導(dǎo)α1亞基表達36 h，在誘導(dǎo)表達12 h后消化細胞，將誘導(dǎo)表達的GABAAR-CHO細胞按照每孔1×104個細胞接種到384孔板，繼續(xù)誘導(dǎo)表達24 h后制備成384孔細胞板（檢測前去掉培養(yǎng)基），然后加入20 μL紅色染料孵育30 min；另外，采用含Cl-的緩沖液制備含有0.15 μmol·L-1激動劑 GABA（包含陽性變構(gòu)劑或拮抗劑的GABA溶液）每孔體積為40 μL的化合物板，設(shè)置化合物加樣體積為5 μL；最后將染料孵育過的384孔細胞板和384孔化合物板放入膜電位實時熒光檢測分析系統(tǒng)進行熒光信號檢測，設(shè)置儀器參數(shù)為：檢測時間130 s，每秒1次，前10 s進行基線檢測（獲得熒光信號B0），第11～130秒進行化合物檢測（獲得熒光信號B1）。Tetra型實時熒光定量分析系統(tǒng)檢測GABAAR-CHO細胞膜電位信號的儀器參數(shù)設(shè)置詳見表1。在以下的方法優(yōu)化中主要對緩沖液體系、激動劑GABA濃度、染料類型和染料孵育時間進行優(yōu)化選擇。

Tab.1 lnstrument parameters of FLlPRTETRAfor detection of γ-aminobutyric acid type A receptor（GABAAR）-CHO membrane potential signals

1.3 GABAAR藥物高通量篩選方法優(yōu)化

1.3.1 緩沖液體系選擇

緩沖液體系采用兩因素交叉設(shè)計實驗方法，因素1為緩沖液類型，分別為含Cl-緩沖液和無Cl-緩沖液，因素2為加入體系中的化合物體積，分別為5，10，20和25 μL。

含Cl-緩沖液配方為（mmol·L-1）：CaCl21.26，MgCl20.82，KCl 5.33，NaCl 137.93，KH2PO40.44，Na2HPO40.34，葡萄糖 5.56，HEPES 20，用1 mmol·L-1的NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至7.4；無Cl-緩沖液配方為（mmol·L-1）：葡萄糖酸鈣 1.26，葡萄糖酸鎂 0.82，葡萄糖酸鉀 5.33，葡萄糖酸鈉137.93，KH2PO40.44，Na2HPO40.34，葡萄糖 5.56，HEPES 20，用1 mmol·L-1的NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至7.4。

以GABA 1.00 μmol·L-1和GABA 0.15 μmol·L-1+Dia 30 μmol·L-1的檢測信號曲線獲得的激活值（activation signal value，ASV）（首先將第60～80秒的熒光信號B1對前10 s基線檢測B0歸一化處理，扣除本底后的數(shù)據(jù)的平均值）和Z′因子作為判定指標，判定緩沖液類型與化合物加樣體積對GABAAR膜電位高通量篩選方法的影響。Z′=1-3×（s樣本信號+s本底信號）/|xˉ樣本信號-xˉ本底信號|。

1.3.2 檢測體系中激動劑GABA濃度選擇

分別在10%激動效應(yīng)濃度（excitatory concentration of 10%，EC10），EC20和EC50GABA濃度（即0.05，0.10 和 0.25 μmol·L-1）條件下，對 Dia 的12個濃度梯度濃度（0.0005，0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10，30和90 μmol·L-1）進行熒光信號檢測，將第11～130秒的熒光信號B1對前10 s基線檢測B0作歸一化處理，扣除本底后獲得檢測信號曲線，計算該曲線下面積（area under curve，AUC）。以化合物濃度的常用對數(shù)值為橫坐標，以相對活性百分率（relative activity percentage，RAP，以工具化合物的最大激動或抑制信號曲線的AUC值作為100%，對各濃度下的AUC值進行百分比計算則為該濃度的RAP）為縱坐標，采用Origin 2019軟件進行l(wèi)ogistic曲線擬合，獲得不同GABA濃度下，陽性變構(gòu)劑Dia的EC50值，以該值作為判定指標，將測得Dia EC50值較低（靈敏度較高）的GABA的濃度作為GABA激活受體的濃度。

1.3.3 染料選擇

分別采用紅色和藍色染料孵育細胞，對激動劑GABA 的 11個濃度梯度（0.0005，0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10和30 μmol·L-1）和陽性變構(gòu)劑Dia的12個濃度梯度（0.0005、0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10，30和90 μmol·L-1）進行熒光信號檢測，并按1.3.2方法對熒光信號的AUC和RAP進行計算，以化合物濃度的對數(shù)值為橫坐標，以各濃度的RAP為縱坐標，對GABA和Dia的EC50進行檢測。以GABA和Dia的活性EC50值以及在2個化合物EC80濃度下獲得的ASV和Z′因子作為判定指標，判定染料的適用性。

1.3.4 染料孵育時間

分別在細胞與染料孵育10，30，50和120 min條件下，其余步驟同1.3.3，判定染料孵育的最佳時間。

1.4 GABAAR藥物高通量篩選方法穩(wěn)定性

采用優(yōu)化方法分別對不同濃度的激動劑GABA（0.05，0.25和1.00 μmol·L-1）、陽性變構(gòu)劑Dia（1，5和30 μmol·L-1）和拮抗劑 Gab（0.1，1.0和10.0 μmol·L-1）進行批間精密度考察，各濃度設(shè)6個復(fù)孔，連續(xù)檢測3 d。通過對3個化合物在不同濃度下熒光信號的AUC進行統(tǒng)計分析，計算獲得批間變異系數(shù)（coefficient of variation，CV%），以評價方法的精密度；計算工具化合物各濃度下的Z′因子，判定方法測定數(shù)據(jù)的質(zhì)量，以評估方法的穩(wěn)定性。

1.5 GABAAR藥物高通量篩選方法靈敏度

采用優(yōu)化的檢測條件對工具化合物激動劑GABA 的 11個濃度梯度（0.0005，0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10和30 μmol·L-1），陽性變構(gòu)劑Dia的11個濃度梯度（0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10，30 和90 μmol·L-1）和拮抗劑Gab的12個濃度梯度（0.0005，0.0015，0.0046，0.014，0.041，0.12，0.37，1.11，3.33，10，30和90 μmol·L-1）進行熒光信號檢測，并對熒光信號的AUC進行計算分析。各濃度均設(shè)4個復(fù)孔。以化合物濃度的常用對數(shù)值為橫坐標，以各濃度的RAP為縱坐標，采用Origin 2019軟件進行l(wèi)ogistic曲線擬合，獲得化合物的EC50或50%抑制效應(yīng)濃度（inhibitory concentration，IC50），以評價方法的檢測靈敏度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GABAAR藥物高通量篩選反應(yīng)體系構(gòu)建

熒光信號檢測結(jié)果（圖1）顯示，GABAAR-CHO細胞上，GABA 0.15 μmol·L-1對在誘導(dǎo)表達 α1亞基的GABAAR-CHO細胞有明顯的激動作用；在Dia 30 μmol·L-1存在下，GABA 0.15 μmol·L-1對細胞的激活作用進一步增強（圖1A）；在Gab 10.0 μmol·L-1存在下，GABA 0.15 μmol·L-1對細胞的激活作用被削弱（圖1B）；單獨應(yīng)用陽性變構(gòu)劑Dia 30 μmol·L-1或含Cl-緩沖液均對細胞無明顯激活作用。

2.2 GABAAR藥物高通量篩選方法優(yōu)化

2.2.1 不同緩沖液體系對篩選檢測指標的影響

實驗通過含Cl-緩沖液和無Cl-緩沖液與5，10，20和25μL加樣體積交叉設(shè)計，對GABA 1.00μmol·L-1和 GABA 0.15 μmol·L-1+Dia 30 μmol·L-1的 ASV 和Z′因子計算結(jié)果見圖2。在檢測GABA信號時，在不同的加樣體積下，各含Cl-組和無Cl-組的ASV值和Z′因子之間均無顯著差異（圖2A和2C）。在檢測陽性變構(gòu)劑Dia信號時，在不同的加樣體積下，各含Cl-組ASV值均明顯高于無Cl-組（P＜0.05）（圖2B），含Cl-組Z′因子均大于無Cl-組（圖2D），隨著加樣體積的增加，2組ASV和Z′因子均減小，其中ASV在加樣體積10，20和25 μL時較加樣體積5 μL時顯著減少（P＜0.05）（圖2B）。

2.2.2 不同激動劑濃度對變構(gòu)劑檢測的影響

分別在GABA終濃度0.05，0.10和0.25 μmol·L-1下，對不同Dia濃度下AUC值進行檢測，結(jié)果（表2）顯示，在不同GABA濃度下，陽性變構(gòu)劑Dia的EC50值隨激動劑GABA濃度增大而逐漸減小。與GABA EC10濃度下Dia檢測結(jié)果相比，在GABA EC20和GABA EC50濃度下，Dia的 EC50檢測值更低（P＜0.05），檢測更靈敏。

Tab.2 Effect of GABA activation concentration on excitatory concentration of 50%（EC50）of allosteric activity Dia

2.2.3 不同染料對篩選檢測指標的影響

采用紅色或藍色染料孵育細胞時，分別檢測激動劑GABA、陽性變構(gòu)劑Dia的活性，其EC50、ASV和Z′因子見圖3和表3。不同染料孵育下，激動劑GABA檢測的EC50值、ASV、Z′因子的檢測結(jié)果無顯著性差異，變構(gòu)劑Dia的ASV大小無明顯差異；在對變構(gòu)劑Dia的EC50檢測時，藍色染料比紅色染料的EC50增大約2.73倍（P＜0.05）；紅色染料Z′因子（0.59）顯著高于藍色染料Z′因子（0.40）（表3）。表明使用GABAAR-CHO細胞對陽性變構(gòu)劑Dia引起的膜電位檢測時，紅色染料檢測靈敏度比藍色染料更高。

Tab.3 Effect of dye on concentration-effect relationships of GABA and Dia

2.2.4 不同染料孵育時間對篩選檢測指標的影響

分別將細胞與染料孵育10，30，50和120 min，檢測激動劑GABA和陽性變構(gòu)劑Dia的活性，其EC50值、ASV、Z′因子的檢測結(jié)果（圖4，表4）顯示，在染料孵育30和50 min條件下，GABA和Dia的EC50值較染料孵育10和120 min條件下更低（P＜0.05），檢測靈敏度更高；在染料孵育30和50 min條件下，GABA和Dia的Z′因子較染料孵育10和120 min條件下更高，檢測穩(wěn)定性更好。表明染料孵育時間控制在30～50 min更適于對GABAAR活性化合物的檢測。

Tab.4 Effect of dye on concentration-effect relationships of GABA and Dia

2.3 GABAAR藥物高通量篩選方法的穩(wěn)定性

如表5所示，使用優(yōu)化后膜電位檢測方法，對GABA（0.05，0.25 和 1.00 μmol·L-1）、Dia（1，5 和30 μmol·L-1）和 Gab（0.1，1.0 和 10.0 μmol·L-1）的熒光信號AUC值進行批間變異系數(shù)CV%和Z′因子的計算，3個化合物在不同濃度下CV%均≤15.64%，其中，在GABA 0.25 和1.00 μmol·L-1、Dia 5和 30 μmol·L-1及 Gab 10.0 μmol·L-1條件下測得的CV%均≤10%。在GABA 0.25和1.00 μmol·L-1、Dia 5和30 μmol·L-1和Gab 1.0和10.0 μmol·L-1條件下測得的Z′因子均≥0.4。結(jié)果表明，優(yōu)化后GABAAR藥物高通量篩選方法可用于GABAAR相關(guān)化合物的活性檢測，該方法穩(wěn)定性較高。

Tab.5 Stability of high throughput screening method for GABA，Dia and Gab

2.4 GABAAR藥物高通量篩選方法的靈敏度

采用優(yōu)化后的GABAAR藥物高通量篩選方法對激動劑GABA、陽性變構(gòu)劑Dia和拮抗劑Gab的劑量-效應(yīng)關(guān)系進行檢測，結(jié)果見圖5。獲得GABA的EC50值為（137.4±26.3）nmol·L-1，Dia的EC50值為（3.2±0.7）μmol·L-1，Gab的 IC50值為（164.9±36.6）nmol·L-1。

3 討論

GABAAR作為Cl-通道受體，與抗焦慮、鎮(zhèn)靜、睡眠等生理活動密切相關(guān)。高通量篩選作為藥物發(fā)現(xiàn)最有效的技術(shù)手段之一，已廣泛應(yīng)用于靶向藥物篩選［9］。為了開發(fā)新型抗焦慮、鎮(zhèn)靜、促睡眠藥物，本研究利用電壓敏感染料可以電壓依賴方式在細胞內(nèi)外質(zhì)膜間轉(zhuǎn)移從而產(chǎn)生熒光信號變化的原理［10-11］，在GABAAR-CHO細胞株上構(gòu)建了GABAAR藥物高通量篩選方法，該方法實現(xiàn)了對激動劑、陽性變構(gòu)劑、拮抗劑等靶向GABAAR的不同性質(zhì)化合物藥理學(xué)作用的檢測，檢測特異性好。

在方法優(yōu)化中，以EC50值、ASV和Z′因子為評價指標，對緩沖液體系、激動劑GABA激活濃度、染料種類以及染料孵育時間等條件進行了優(yōu)化選擇。其中，在高通量篩選中，需要使用陽性化合物來評估篩選條件和測量方法的質(zhì)量，從而預(yù)測高通量篩選方法的可行性，Z′因子作為度量標準，是一個無量綱的參數(shù)，該參數(shù)不僅用于評估測定數(shù)據(jù)的質(zhì)量，還用于評價陽性對照與本底信號之間的分離度以及陽性對照信號動態(tài)變化范圍。在各種濃度下均可計算Z′因子。多數(shù)文獻采用EC80濃度下計算Z′因子，優(yōu)化后的高通量方法在該濃度下的Z′因子≥0.4，通常認為高通量檢測方法是可行的，該方法中陽性和陰性對照的分離度較好，可用于高通量篩選［10］。本研究以激動劑GABA和陽性變構(gòu)劑Dia為模型化合物，選擇EC50值較低，ASV較高，Z′因子較大的條件作為優(yōu)化后條件，分別獲得優(yōu)化后的條件為，使用含GABA EC20～EC50濃度的5 μL含Cl-加樣體積，對使用紅色染料孵育30～50 min的GABAAR-CHO細胞進行工具化合物的檢測，Z′因子均≥0.4，符合高通量檢測要求。

方法穩(wěn)定性考察表明，對不同濃度的激動劑GABA、陽性變構(gòu)劑Dia和拮抗劑Gab進行檢測的CV%分別介于4.09%～15.30%、5.59%～8.30%和5.65%～15.64%；對3個工具化合物在高濃度（GABA 1 μmol·L-1，Dia 30 μmol·L-1和 Gab 10 μmol·L-1）下測得的Z′因子分別為0.861，0.558和0.817，在中濃度（GABA 0.25 μmol· L-1，Dia 5 μmol· L-1，Gab 1 μmol·L-1）下測得的 Z′因子分別為 0.822，0.400和0.712。表明本方法優(yōu)化后檢測精密度較好，檢測數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，符合高通量篩選方法對數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和穩(wěn)定性的要求。

本研究采用優(yōu)化后的方法對工具化合物劑量-效應(yīng)關(guān)系進行檢測，以評價本方法可靠性。實驗結(jié)果顯示，采用本方法測得激動劑GABA的EC50值為（137.4±26.3）nmol·L-1。文獻報道，采用膜電位檢測方法在表達GABAAR的HEK293細胞上對GABA檢測的 EC50值為 2.2～4.7 μmol·L-1［11-12］，本方法靈敏度較文獻方法高16～34倍；文獻報道，采用電生理方法在表達GABAAR的爪蟾卵母細胞上對GABA 檢測的 EC50值為 7.3～51.2 μmol·L-1［13-15］，本方法較電生理檢測方法靈敏度高＞53倍。采用本方法檢測得陽性變構(gòu)劑Dia的EC50值為（3.2±0.7）μmol·L-1。文獻報道，采用膜電位檢測方法在表達GABAAR的HEK293細胞上檢測到Dia的EC50值為 10.0 μmol·L-1，本方法靈敏度比該文獻方法提高約3倍［14-15］；文獻用電生理方法在表達GABAAR的爪蟾卵母細胞上檢測到Dia的EC50值為44.0～71.9 μmol·L-1［14-15］，本方法靈敏度比該文獻方法高14～22倍。采用本方法測得拮抗劑Gab的IC50值為（164.9±36.6）nmol·L-1。文獻報道，用電生理方法在表達GABAAR的爪蟾卵母細胞上測得Gab的IC50值為（0.15±0.01）μmol·L-1［16］，本方法靈敏度與該文獻報道方法基本相當。結(jié)果證實，本研究中構(gòu)建并優(yōu)化的GABAAR藥物高通量檢測方法檢測靈敏度較高。

本研究建立并優(yōu)化的GABAAR藥物高通量篩選方法特異性好、精密度高，穩(wěn)定可靠，靈敏度高，為靶向GABAAR的鎮(zhèn)靜睡眠類、抗焦慮等先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。