雷公藤甲素生殖毒性及其防治策略研究進(jìn)展

李英奇，王 恒，李嫚琪，楊紫軒，許瀚林，常 艷

（1.上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海 201620；2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203；3.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203）

雷公藤甲素是一種二萜三環(huán)氧化物，可從雷公藤的根、葉、花及果實中提取，是雷公藤中最主要的生物活性成分，也是迄今發(fā)現(xiàn)的功能、活性較強的抗炎和免疫調(diào)節(jié)天然產(chǎn)物之一［1］。由于其在抗癌［2］、抗炎［3］和免疫抑制［4］等方面的良好作用，臨床上已將雷公藤甲素用于治療腫瘤［5］及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）［6］和系統(tǒng)性紅斑狼瘡［7］等自身免疫疾病。然而，其對生殖系統(tǒng)、肝、腎、心臟和胃腸道等存在嚴(yán)重不良作用［8］，其中，生殖系統(tǒng)毒性主要表現(xiàn)為精子數(shù)量和活力下降［9］及卵泡凋亡［10］等。目前臨床投入使用的雷公藤甲素單體制劑較少，常用的含雷公藤甲素的藥物主要有雷公藤片和雷公藤多苷片等［11］，但不同廠家的藥物中雷公藤甲素含量相差較大［12］，且生殖毒性和作用機制尚不明確，限制了其臨床應(yīng)用。因此，對雷公藤甲素的生殖毒性、作用機制和增效減毒措施的研究具有重要臨床意義。

1 生殖毒性

雷公藤甲素的雄性生殖毒性主要體現(xiàn)在損害精子和睪丸細(xì)胞，及擾亂雄性激素等，其雌性生殖毒性主要體現(xiàn)在破壞子宮和卵巢的正常生理功能。

1.1 精子損傷

雷公藤甲素對生殖系統(tǒng)的影響之一是對精子的損傷。Ma等［13］報道，雄性小鼠ip給予雷公藤甲素60 μg·kg-12周后，小鼠附睪中精子數(shù)量減少。Wang等［9］ig給予雄性SD大鼠雷公藤甲素50和100 μg·kg-190 d后，大鼠精子密度和活力均顯著降低。黃鄭雋等［14］ig給予雄性Wistar大鼠雷公藤甲素25，50和100 μg·kg-130 d后，大鼠精子畸形率顯著增加，精子頭部發(fā)生明顯畸形，表現(xiàn)出無頭、細(xì)長型、無定型和無鉤等類型。Xiong等［15］ig給予C57BL/6J小鼠雷公藤甲素50 μg·kg-135 d后，小鼠精子畸形率增加約45.75%。

1.2 睪丸細(xì)胞損傷

雷公藤甲素可在睪丸中顯著累積，睪丸是其最主要的靶器官［16］。雄性小鼠ip給予雷公藤甲素60 μg·kg-12周后，小鼠睪丸生殖細(xì)胞明顯脫落、減少［13］。Hu等［17］用雷公藤甲素20，40和60 nmol·L-1處理SD大鼠間質(zhì)細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞活力下降并發(fā)生凋亡。Wang等［9］從SD大鼠睪丸分離支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，與雷公藤甲素5，25，125，625和3000 nmol·L-1共孵育。結(jié)果表明，與細(xì)胞對照組相比，625和3000 nmol·L-1組支持細(xì)胞活力顯著降低，支持細(xì)胞與生殖細(xì)胞的黏附連接被破壞，而5，25和125 nmol·L-1組未觀察到顯著差異。Zhang等［18］利用接近抗腫瘤劑量的雷公藤甲素（0.02，0.1，0.5和2.5 μmol·L-1）與小鼠支持細(xì)胞和小鼠精母細(xì)胞系（GC-2spd和GC2）共同孵育，結(jié)果表明，雷公藤甲素可使支持細(xì)胞和GC2的活力降低，并發(fā)生凋亡和自噬。Wang等［19］將小鼠支持細(xì)胞用雷公藤甲素 0.05，0.1，0.5，1 和 5 μmol·L-1處理24 h，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可導(dǎo)致支持細(xì)胞收縮或失去黏附能力。

1.3 卵巢和子宮損傷

Zeng等［10］為確定雷公藤甲素25和50 μg·kg-1對卵巢功能的影響，在10 d內(nèi)檢測了NIH小鼠的發(fā)情周期，發(fā)現(xiàn)ig給予雷公藤甲素的小鼠發(fā)情周期延長，但發(fā)情期縮短。病理結(jié)果顯示，雷公藤甲素組小鼠卵巢表面萎縮、蒼白、粗糙，卵巢的初級卵泡、次級卵泡、原始卵泡和成熟卵泡數(shù)量減少。Tang等［20］ig給予19日齡雌性C57BL/6小鼠雷公藤甲素 30，60 和 90 μg·kg-1，發(fā)現(xiàn)小鼠子宮重量顯著降低，HE染色見子宮上皮細(xì)胞變性和壞死。

2 生殖毒性機制

近年來隨著對雷公藤甲素生殖毒性的研究，研究者們已發(fā)現(xiàn)多種雷公藤甲素生殖毒性作用機制，如引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、損傷線粒體和破壞細(xì)胞骨架與細(xì)胞間的粘附連接等。

2.1 引起氧化應(yīng)激和線粒體損傷

氧化應(yīng)激和線粒體損傷是雷公藤甲素引發(fā)睪丸毒性的重要原因，并影響精子功能。Hu等［17］報道，雷公藤甲素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是引起睪丸間質(zhì)細(xì)胞毒性作用的原因，與氧化應(yīng)激相關(guān)的線粒體膜電位和細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt-c）分別降低和增加。此外，凋亡相關(guān)的蛋白Bcl-2、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3表達(dá)，共同引發(fā)線粒體損傷，最終致使細(xì)胞凋亡。有關(guān)雷公藤甲素對支持細(xì)胞影響的研究很少，其毒性的分子機制尚不清楚。Wang等［19］報道了雷公藤甲素誘導(dǎo)睪丸支持細(xì)胞毒性的機制，發(fā)現(xiàn)支持細(xì)胞中的線粒體死亡介導(dǎo)睪丸毒性，而線粒體死亡是由活性氧（reactive oxygen species，ROS）/c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途徑激活和核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）途徑抑制所介導(dǎo)，導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)失活，觸發(fā)線粒體死亡，引發(fā)細(xì)胞凋亡。Cheng等［21］研究了線粒體功能和代謝與雷公藤甲素誘導(dǎo)支持細(xì)胞毒作用的相關(guān)性。結(jié)果表明，雷公藤甲素通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α〔peroxisome proliferator activated receptor（PPAR）-γ coactivator-1α，PGC-1α〕活性、抑制Sirtuin 1蛋白水平、調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶水平，引發(fā)線粒體功能障礙，導(dǎo)致睪丸毒性。而線粒體損傷減少乳酸的產(chǎn)生，使脂肪酸代謝失調(diào)，導(dǎo)致生殖細(xì)胞能量不足，進(jìn)一步導(dǎo)致睪丸毒性。

2.2 破壞細(xì)胞間肌動蛋白的黏附連接

支持細(xì)胞骨架是睪丸毒物的主要靶點之一，支持細(xì)胞中Rho家族的小分子Rho GTP酶可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和連接。Wang等［9］研究結(jié)果顯示，雷公藤甲素通過抑制Rho GTP酶的表達(dá)，破壞細(xì)胞骨架以及細(xì)胞之間的黏附連接，導(dǎo)致精子功能障礙，是生殖細(xì)胞損傷的主要原因。為了明確潛在的調(diào)控途徑，他們還檢測了Rho GTP酶最重要的下游分子Rho相關(guān)激酶Rock的表達(dá)，結(jié)果表明，雷公藤甲素使Rock1和Rock2mRNA水平降低，提示Rho-Rock可能參與了生殖毒性的調(diào)節(jié)。

2.3 導(dǎo)致睪酮和關(guān)鍵酶水平下降

睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志酶分別為6-磷酸葡萄糖脫氫酶和β-葡萄糖醛酸苷酶，其活力水平會影響細(xì)胞的生理功能。線粒體標(biāo)志酶琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）、溶酶體標(biāo)志酶酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、生精上皮細(xì)胞標(biāo)志酶乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和精子能量利用的主要酶腺苷三磷酸酶與生精能力、生精過程和精子運動相關(guān)。雷公藤甲素會使這些標(biāo)志酶的活性明顯下降，導(dǎo)致支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞損傷，從而可能導(dǎo)致睪酮分泌減少，損害生精功能，是雄性生殖功能損傷的一個重要機制［14］。Ma等［13］研究發(fā)現(xiàn)，雄性小鼠ip給予雷公藤甲素以60 μg·kg-1后，睪丸組織中的睪酮、SDH、ACP和LDH水平降低。

2.4 導(dǎo)致關(guān)鍵蛋白表達(dá)異常

雷公藤甲素還會引起某些蛋白表達(dá)異常，從而導(dǎo)致睪丸毒性。在睪丸中表達(dá)的乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）可以影響藥物在睪丸中的分布，但其在雷公藤甲素誘導(dǎo)的睪丸損傷中的作用尚不明確。Li等［16］運用bcrp基因敲除FVB小鼠進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素會降低睪丸中BCRP mRNA和蛋白水平，進(jìn)一步增加雷公藤甲素在睪丸中的含量，增強毒性作用。在細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用的PPAR可能是導(dǎo)致精子功能障礙和支持細(xì)胞代謝異常的關(guān)鍵調(diào)控因子。Ma等［13］利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從分子水平研究了小鼠給予雷公藤甲素后睪丸組織代謝物變化，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可介導(dǎo)PPAR下調(diào)，使睪丸脂質(zhì)和能量代謝異常，導(dǎo)致精子損傷。

雷公藤甲素的雌性生殖毒性機制也與蛋白質(zhì)的表達(dá)異常相關(guān)。Zheng等［22］通過構(gòu)建分子網(wǎng)絡(luò)研究雷公藤甲素的雌性生殖毒性，發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶3、TP53和MYC靶向蛋白可以調(diào)控卵巢中21個蛋白的表達(dá)，是引起雌性生殖毒性的主要原因，但還需要在動物體內(nèi)進(jìn)一步驗證。此外，卵巢中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein）表達(dá)抑制［10］，雌激素受體 α和孕激素受體表達(dá)下調(diào)都是雷公藤甲素誘導(dǎo)的卵巢毒性的潛在機制［20］。

2.5 導(dǎo)致長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA，cRNA）、mRNA和微RNA（microRNA，miRNA）表達(dá)異常

黃鄭雋等［23］研究發(fā)現(xiàn)，凋亡基因Bax、Fas、FasL、胱天蛋白酶3及抑制凋亡基因Bcl-2和環(huán)腺苷酸反應(yīng)成分調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)異常，很可能是誘導(dǎo)大鼠生殖細(xì)胞凋亡的重要原因。此外，還有一些RNA也可能與雷公藤甲素的生殖毒性相關(guān)。lncRNA和cRNA在內(nèi)的非編碼RNA是一種新型調(diào)控分子，與多種生理活動相關(guān)，對男性生育能力至關(guān)重要，然而是否與雷公藤甲素誘導(dǎo)的生殖毒性有關(guān)尚不清楚。Xiong等［15］通過RNA測序獲得雷公藤甲素誘導(dǎo)的雄性生殖毒性小鼠的全基因組lncRNA、cRNA和mRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素給藥組小鼠睪丸中檢測到部分lncRNA，cRNA和mRNA表達(dá)失調(diào)，提示其可能是雷公藤甲素誘導(dǎo)生殖毒性的標(biāo)志物。為進(jìn)一步研究特定lncRNA在雷公藤甲素誘導(dǎo)的GC2細(xì)胞毒性中的作用，Zhang等［18］選擇Obox4-ps35（最顯著上調(diào)的lncRNA之一）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)敲除Obox4-ps35可以保護(hù)該細(xì)胞避免雷公藤甲素誘導(dǎo)的毒性，但仍需進(jìn)一步研究闡明具體機制，并確定這種lncRNA調(diào)控的特定靶基因或信號通路。miRNA是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，參與細(xì)胞凋亡、分化和存活等過程。Han等［23］構(gòu)建體外細(xì)胞模型研究生精障礙患者中顯著上調(diào)的miR-200a在生精障礙中的調(diào)節(jié)機制。結(jié)果顯示，miR-200a下調(diào)可保護(hù)間質(zhì)細(xì)胞，也可通過觸發(fā)自噬來改善雷公藤甲素誘導(dǎo)的小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

3 防治策略

雷公藤甲素具有抗炎、抗癌等藥理活性，然而其生殖毒性限制了其臨床應(yīng)用。為發(fā)揮雷公藤甲素的臨床應(yīng)用價值，有必要對其生殖毒性緩解措施進(jìn)行研究。目前主要包括研發(fā)雷公藤甲素緩解毒性藥物、對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾及開發(fā)新型遞藥系統(tǒng)等。

3.1 尋找潛在的抗毒配伍藥物

槲皮素是具有氧化應(yīng)激保護(hù)功能的黃酮類化合物之一。Hu等［17］用雷公藤甲素（20，40和60 nmol·L-1）處理睪丸間質(zhì)細(xì)胞24 h，引起明顯的氧化應(yīng)激；而將槲皮素（2.5，5，10和20 μmol·L-1）與雷公藤甲素聯(lián)合給藥24 h后，槲皮素 5 μmol·L-1可顯著提高間質(zhì)細(xì)胞活力，其作用機制與ROS減少、線粒體膜電位下降和Cyt-c釋放減少、凋亡相關(guān)蛋白（Bax、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3）表達(dá)下調(diào)相關(guān)。Zhang等［24］研究也發(fā)現(xiàn)，靶向線粒體的抗氧化劑MitoQ（1.3，2.6和5.2 mg·kg-1）與雷公藤甲素120 μg·kg-1分別ig或ip給予雄性ICR小鼠14 d后，可以保護(hù)血睪屏障（blood-testis barrier，BTB）完整性、睪丸組織的微觀結(jié)構(gòu)和精子形態(tài)。MitoQ可激活腫瘤抑制因子Keap1-Nrf2抗氧化防御系統(tǒng)，上調(diào)線粒體融合蛋白2和動力相關(guān)蛋白1的表達(dá)，并對線粒體產(chǎn)生保護(hù)作用，進(jìn)而抑制雷公藤甲素誘導(dǎo)的生殖毒性。

用于預(yù)防和治療男性不育癥的傳統(tǒng)藥用植物杜仲的活性成分桃葉珊瑚苷也可能緩解雷公藤甲素生殖毒性。Ma等［25］ip給予雄性小鼠雷公藤甲素120 μg·kg-1，1 h后ip給予不同劑量桃葉珊瑚苷（5，10和20 mg·kg-1，發(fā)現(xiàn)桃葉珊瑚苷可減少雷公藤甲素誘導(dǎo)的睪丸損傷、細(xì)胞凋亡、精子形態(tài)異常和BTB破壞。桃葉珊瑚苷通過抑制蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶/核轉(zhuǎn)錄因子和JNK途徑預(yù)防凋亡，通過上調(diào)緊密連接蛋白（ZO-1，occludin和claudin-11）和間隙連接蛋白43的表達(dá)保護(hù)BTB的完整性。

含木犀草素的蔬菜和水果顯示出對男性生殖系統(tǒng)的有益作用。Ma等［26］用木犀草素2.5，5和10 μmol·L-1與雷公藤甲素 500 nmol·L-1共同處理小鼠支持細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)木犀草素可通過激活細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性并上調(diào)間隙連接蛋白43的表達(dá)，減少雷公藤甲素導(dǎo)致的睪丸損傷。

3.2 對化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾

對雷公藤甲素進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾可以降低其生殖毒性，提高其穩(wěn)定性和治療效果。Qi等［27］將雷公藤甲素結(jié)構(gòu)修飾成雷公藤內(nèi)酯氨基糖苷（triptolide aminoglycoside，TPAG），在治療雄性昆明小鼠腎缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，IRI）的研究中，TPAG進(jìn)入動物體內(nèi)后24 h內(nèi)保持穩(wěn)定，與雷公藤甲素相比，可在更低劑量（0.22 mg·kg-1）有效治療IRI。睪丸組織病理檢測結(jié)果顯示，TPAG組精子及間質(zhì)組織形態(tài)正常，病理變化很小，而雷公藤甲素組生殖細(xì)胞嚴(yán)重退化、剝離，生精小管萎縮。Fu等［28］對雷公藤甲素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾得到其衍生物ZT01，在治療雄性C57BL/6小鼠炎癥性腸病的研究中，ZT01在0.1，0.3和1.0 mg·kg-1可劑量依賴性改善炎癥性腸病相關(guān)癥狀，治療效果優(yōu)于雷公藤甲素0.1 mg·kg-1，且降低了對睪丸的毒性，但ZT01的相關(guān)毒性和機制還需進(jìn)一步研究。

3.3 開發(fā)新型納米遞送系統(tǒng)

使用納米遞送系統(tǒng)遞送藥物是一種有效降低雷公藤甲素毒性的方式，納米遞送方法不僅治療劑量低于化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾方法，毒性也相對較低。Huang等［29］開發(fā)了負(fù)載雷公藤甲素的納米顆粒（TP-F127/P123 nanoparticles，TP-FPNP），在雄性IRI模型小鼠上，TP-FPNP具有良好的腎靶向性，被腎小管細(xì)胞吞噬后，可緩慢釋放雷公藤甲素，從而實現(xiàn)IRI治療。該研究表明，TP-FPNP與雷公藤甲素相比，穩(wěn)定性較好，且療效顯著、毒性較低。Deng等［30］開發(fā)了另外一種包封雷公藤甲素的納米顆粒（triptolide-encapsulated mesoscale nanoparticles），在雄性IRI模型小鼠上，不僅腎靶向能力強，且在極低劑量（0.01 mg·kg-1）便具有良好療效，與雷公藤甲素相比，生殖毒性較低。Zhang等［31］設(shè)計的半乳糖基化殼聚糖-雷公藤甲素-納米顆粒（galactosylated-chitosan-TP-nanoparticles），在人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系荷瘤裸鼠上顯示出比雷公藤甲素更好的療效，可有效抑制癌癥發(fā)展，有效降低雷公藤甲素的雄性生殖毒性。Liu等［32］開發(fā)的雷公藤甲素負(fù)載納米藥物（TP-loaded nanomedicine，TP@NP），在Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型小鼠上表現(xiàn)出顯著的軟骨保護(hù)和抗炎作用，且TP@NP給藥組小鼠子宮內(nèi)膜厚度均勻，細(xì)胞核相對完整，接近正常小鼠。將RAW264.7細(xì)胞用雷公藤甲素40 nmol·L-1或TP@NP（含40 nmol·L-1雷公藤甲素）處理24 h后，TP@NP與游離雷公藤甲素相比，減少了細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)語

雷公藤甲素對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生的不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為精子活力和生育能力下降、睪丸萎縮、睪丸細(xì)胞凋亡、卵泡數(shù)量減少和排卵功能損傷等，其毒性機制與氧化應(yīng)激、線粒體損傷、細(xì)胞間肌動蛋白黏附連接破壞、酶（包括6-磷酸葡萄糖脫氫酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、SDH、ACP、LDH和腺苷三磷酸酶）活力下降及蛋白（包括BCRP、PPAR、胱天蛋白酶3TP53MYC靶向蛋白、連鎖凋亡抑制蛋白、雌激素受體α和孕激素受體）表達(dá)異常等因素相關(guān)。針對雷公藤甲素的毒性作用，人們嘗試用多種方法減輕其對生殖系統(tǒng)的損傷，如將其與緩解毒性藥物聯(lián)用、對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾、開發(fā)新型遞藥系統(tǒng)等。盡管取得諸多進(jìn)展，但其生殖毒性及作用機制仍不十分明確，且其與緩解藥物的實驗劑量難以準(zhǔn)確應(yīng)用于臨床；結(jié)構(gòu)修飾和遞送系統(tǒng)的研究目前也僅處于動物模型實驗階段。因此，還需進(jìn)一步研究緩解雷公藤甲素不良反應(yīng)并提高其藥效的措施，以滿足臨床應(yīng)用的需求。