HPLC 法測(cè)定酒升麻飲片中異阿魏酸的含量

佘永紅，楊德泉，吉林芳

湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 吉首 416000

升麻為毛茛科植物大三葉升麻Cimicifuga heracleifoliaKom.、興安升麻Cimicifuga dahurica（Turcz.）Maxim.或升麻Cimicifuga foetidaL.的干燥根莖。升麻用藥歷史悠久，《太平惠民和劑局方》中收載的升麻葛根湯，升麻為方中君藥，配伍芍藥、葛根、甘草，主治麻疹不透。李時(shí)珍曰［1］：“升麻引陽明清氣上升，柴胡引少陽清氣上升?！崩铌降那Ч琶窖a(bǔ)中益氣丸，方中以升麻、柴胡為佐藥，諸藥合用，補(bǔ)中益氣，治療氣虛下陷證。升麻鱉甲湯出自《金匱要略》，治陽毒，具有清熱、解毒、散瘀的功效?，F(xiàn)代臨床研究報(bào)道，含有升麻的清胃散常用于治療牙周炎、慢性胃炎［2-3］；升麻在舌癌、支氣管肺癌、直腸癌及宮頸癌等癌癥中均有配方使用，升麻鱉甲湯加減可以有效治療及輔助治療急性白血病、急性髓系白血病及慢性粒細(xì)胞白血病［4-7］；升麻可以緩解圍絕經(jīng)期綜合征［8-9］，成分為升麻總皂苷的中成藥希明婷片，用于女性圍絕經(jīng)期綜合征，臨床使用安全有效。

升麻主要含有三萜及其苷類、酚酸類及色原酮類等成分，《中國藥典》2020 年版一部［10］未收載酒升麻飲片標(biāo)準(zhǔn),《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范》2010 年版［11］酒升麻收載在升麻項(xiàng)下，標(biāo)準(zhǔn)僅收載成品性狀、鑒別、浸出物等項(xiàng)目，為了保證酒升麻質(zhì)量的可控，本研究采用HPLC 法研究測(cè)定酒升麻中酚酸類活性成分之一的異阿魏酸含量，為酒升麻飲片質(zhì)量控制提供有效手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀，檢測(cè)器：VWD ；色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），型號(hào)：880975-902，Agilent 公司；島津電子天平AUW220D，最大量程：82/220 g，稱量精度：0.01 mg/0.1 mg；ZOOMWO Water Environmental 超純水機(jī)；DZTW 電子調(diào)溫電熱套。

1.2 試藥

異阿魏酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，含量測(cè)定用，批號(hào)：111698-201904，純度：99.3%）。甲醇、乙腈為色譜純；水為純凈水；其他試藥均為分析純。

1.3 樣品

18 批酒升麻飲片，由湖南省6 家生產(chǎn)企業(yè)各提供3 批（分別為19101806-1、19101806-2、19101806-3、2019090608、2019090609、2019090610、201910109、201910110、201910111、202003242019、202003242020、202003242021、19111605-1、19111605-2、19111605-3、20200501-1、20200501-2、20200501-3），產(chǎn)地分別來自黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、四川等。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈-0.1%磷酸溶液（13∶87）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長為316 nm；柱溫30 ℃。理論板數(shù)按異阿魏酸峰計(jì)算，不低于5 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取異阿魏酸對(duì)照品，精密稱定①12.54 mg、②10.67 mg，分別置25 mL 棕色量瓶中，加10%乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液（498.088 8 μg/mL，423.812 4 μg/mL）。精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 mL，分別置25 mL、20 mL量瓶中，加10%乙醇依次稀釋成濃度為19.923 6 μg/mL、21.190 6 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過二號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%乙醇25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流2.5 h，放冷，再稱定重量，用10%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣，異阿魏酸分離度大于1.5，理論板數(shù)均在19 000 以上。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上檢出色譜峰，見圖1～3。

圖1 異阿魏酸對(duì)照品色譜圖

圖2 異阿魏酸樣品色譜圖

圖3 陰性樣品色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取濃度為498.088 8 μg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，依次稀釋成濃度為3.984 7 μg/L、12.452 2 μg/mL、19.923 6 μg/mL、24.904 4 μg/mL、49.808 9 μg/mL、99.617 8 μg/mL、149.426 6 μg/mL的對(duì)照品溶液，精密吸取上述對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為：Y=51.23X+18.352，r=0.999 9。結(jié)果表明：異阿魏酸對(duì)照品在3.984 7 μg～149.426 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一酒升麻供試品溶液（批號(hào)19101806-1），連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，記錄色譜峰面積，計(jì)算RSD（n=6）為0.44%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一酒升麻供試品溶液（批號(hào)19101806-1），分別于配制后的0、2、8、14、24 h，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，異阿魏酸的RSD（n=5）為0.47%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一酒升麻供試品溶液（批號(hào)19101806-1），依法制備6 份供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算，含量分別為0.24%、0.23%、0.23%、0.23%、0.24%、0.23%，RSD%為2.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 耐用性試驗(yàn)

采用擬定的方法，使用不同的液相色譜儀、兩個(gè)不同的色譜柱對(duì)同一批樣品進(jìn)行測(cè)定，（1）儀器：Agilent 1260 Infinity，檢測(cè)器VWD；色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），型號(hào)：880975-902，Agilent 公 司。（2）儀 器：Agilent 1260 Infinity Ⅱ，檢測(cè)器 DAD；色譜柱：Acclaim? Polar Advantage IIC18（250 mm×4.6 mm，5 μm），型號(hào)：JADE-PAK，Thermo 公司。平行測(cè)定同一生產(chǎn)企業(yè)3 個(gè)批號(hào)的樣品（2019090608、2019090609、2019090610），結(jié)果3 份樣品的異阿魏酸含量分別為（1）0.41%、0.38%、0.44%；（2）0.42%、0.38%、0.45%。（1）與（2）測(cè)定的3 份含量結(jié)果之間的RSD 分別為0.18%、0、0.16%。結(jié)果表明，本方法耐用性良好。

2.10 回收率試驗(yàn)

取已測(cè)定含量的同一酒升麻樣品（批號(hào)19101806-1，含異阿魏酸2.331 mg/g）約0.25 g（9份），精密稱定，置錐形瓶中，按干燥品計(jì)算（水分為8.27%），按80%、100%和120%的水平精密加入濃度為423.812 4 μg/mL 的異阿魏酸對(duì)照品適量，見表1，依法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果平均加樣回收率為99.9%。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表

2.11 樣品含量測(cè)定結(jié)果

對(duì)企業(yè)提供的18 批酒升麻樣品進(jìn)行了含量測(cè)定，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別按外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 酒升麻中異阿魏酸含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 提取方法的選擇

酒升麻質(zhì)地較輕,粉末經(jīng)過加熱回流提取,料液的黏度變小,相比超聲提取的方法過濾速度要快，故選擇加熱回流的提取方法。

3.2 升麻酒炙的現(xiàn)狀

升麻始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［12］列為“上品”，宋代《宋氏女科秘書》［13］記載了酒炒升麻。歸納《中國藥典》《全國中藥炮制規(guī)范》及各省中藥飲片炮制規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，有福建、貴州、江西、湖南共4 省中藥飲片炮制規(guī)范收載了酒升麻的飲片標(biāo)準(zhǔn),其中湖南、福建2 個(gè)省采用單一的酒為輔料炒炙，貴州、江西2 個(gè)省采用酒潤麩炒的炮制方法，由于酒升麻臨床用藥經(jīng)驗(yàn)傳承的迭代，酒升麻使用的省份及臨床應(yīng)用受到限制，導(dǎo)致酒升麻炮制工藝得不到統(tǒng)一，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)簡單，避免酒升麻飲片炮制技術(shù)、臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)失傳，亟待提升酒升麻的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，讓酒升麻在炮制技術(shù)、臨床用藥中得以傳承、發(fā)展和創(chuàng)新具有重要意義。

3.3 酒炒升麻的炮制作用

有關(guān)酒升麻的炮制作用，明代的《醫(yī)學(xué)入門》［14］記載：“發(fā)散生用，補(bǔ)中酒炒，止咳升者蜜炙。”清代《本草述鉤元》［15］記載：“發(fā)散生用，補(bǔ)中酒炒，止咳汗蜜炒，治滯下醋拌炒?！鄙鲜鲇涊d認(rèn)為升麻經(jīng)酒制后可增強(qiáng)升麻補(bǔ)中氣的作用，在現(xiàn)代臨床運(yùn)用中，認(rèn)為酒炙后可緩和寒性，并借酒升提之力引藥上行，升麻酒炒后常用于中氣下陷、臟器脫垂、崩漏不止等病癥，在治療中常配伍柴胡、黃芪等藥物。

3.4 酒升麻含量指標(biāo)成分的選擇

異阿魏酸具有解熱、鎮(zhèn)痛、消炎的作用［16］，張啟發(fā)等［17］通過實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論：異阿魏酸下調(diào)β-catenin 和c-Myc 的表達(dá)，誘導(dǎo)A-498 細(xì)胞凋亡，抑制A-498 細(xì)胞增殖，是治療腎癌的潛在候選化合物。本研究選擇酒升麻中的異阿魏酸作為含量指標(biāo)成分，對(duì)18 批次酒升麻中異阿魏酸含量進(jìn)行測(cè)定，含量范圍在0.22%～0.44%，平均值為0.33%。

本研究參照《中國藥典》 2020 年版一部升麻藥材含量測(cè)定的色譜條件，所建立的酒升麻含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、快速，重現(xiàn)性好，為酒升麻的質(zhì)量控制提供了有效的檢測(cè)手段。