宮頸癌病人切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1基因多態(tài)性與鉑類超敏反應(yīng)關(guān)系

侯麗娟，王文文，翟建軍，孫燕

作者單位：首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京100176

多數(shù)宮頸癌病人確診時(shí)病情已進(jìn)展至晚期，單純手術(shù)及放療難以控制，需聯(lián)合新輔助化療［1］。鉑類是宮頸癌化療中最基礎(chǔ)藥物，可結(jié)合癌細(xì)胞DNA堿基產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，干擾DNA 復(fù)制，抑制腫瘤生長(zhǎng)，然而仍有部分病人化療不敏感，預(yù)后較差［2-3］。近年研究發(fā)現(xiàn)，DNA 損傷修復(fù)能力異常是鉑類耐藥重要分子基礎(chǔ)［4］。在人類細(xì)胞中，化療藥物及紫外線所致DNA 損傷主要通過(guò)核苷酸剪切修復(fù)途徑（nucleo?tide excision repair，NER）修復(fù)，而切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（excision repair cross complement 1，ERCC1）在NER 途徑中起著關(guān)鍵作用，如NER 初期發(fā)揮DNA 損傷識(shí)別功能，后期共同行使損害部位5，端切除功能［5］。因此宮頸癌病人ERCC1 基因多態(tài)性與鉑類超敏反應(yīng)關(guān)系的研究成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。本研究旨在宮頸癌病人分析ERCC1 基因多態(tài)性與鉑類超敏反應(yīng)關(guān)系，明確鉑類超敏反應(yīng)危險(xiǎn)因素，為臨床確定合理化療方案提供參考信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012 年1 月至2017 年9 月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院收治的103例宮頸癌病人作為研究對(duì)象，均經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)檢查確診。年齡（42.51±10.68）歲，范圍為20～65 歲。病人或其近親屬知曉并簽署知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法所有病人化療前后均接受肝腎功能、外周血細(xì)胞、心電圖等常規(guī)檢查。35 例接受PBF 方案，d1～d5，靜脈滴注20 mg/m2順鉑，肌內(nèi)注射500 mg/m25-氟尿嘧啶，d1、d5，肌內(nèi)注射博來(lái)霉素7 mg/m2；33 例接受PMF 方案：d1～d5，靜脈滴注0.75～1.00 g/m25-氟尿嘧啶，d1，靜脈滴注6～8 mg/m2絲裂霉素，d1～d3，靜脈滴注40 mg 順鉑；38 例接受PVB 方案：d1、d2，靜脈滴注40 mg 順鉑，d1，靜脈滴注30 mg 長(zhǎng)春新堿，d2，靜脈滴注博來(lái)霉素30 mg；21 d 為1 個(gè)化療周期，連續(xù)化療1～2個(gè)周期后評(píng)估，化療有效且分期較晚者，建議放療；化療有效且分期較早者行盆腔淋巴結(jié)及根治性子宮切除術(shù)，若術(shù)后病理結(jié)果顯示切緣陽(yáng)性、低分化癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等高危因素，給予以放療為主的輔助治療。

化療后切除或活檢腫瘤組織，?80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存待測(cè)。（1）DNA提?。喝⊙簶?biāo)本200μL置于離心管，滴加蛋白酶K 溶液20μL、緩沖液20μL，充分混合均勻，56 ℃放置15 min，直至溶液清亮；滴加無(wú)水乙醇200μL，振蕩混勻，倒入硅膠離心柱，離心30 s，倒掉廢液，將硅膠離心柱放回收集管；于硅膠離心柱滴加緩沖液500μL，離心30 s，倒掉廢液，將硅膠離心柱放回收集管；于硅膠離心柱滴加漂洗液500μL，離心30 s，倒掉廢液，將硅膠離心柱放回收集管，離心2 min，倒掉廢液，室溫下放置數(shù)分鐘，晾干吸附材料中殘余漂洗液；將硅膠離心柱轉(zhuǎn)入干凈離心管，滴加洗脫緩沖液100 μL，室溫放置15 min，離心2 min，離心管收集溶液。（2）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：反應(yīng)體系為2×Taq MasterMix 12.5 μL，引物2 μL，DNA 模板2 μL，雙蒸水8.5 μL，總體積25μL；引物序列：ERCC1 Asn118Asn（rs11615）正向引物5’-CGGGGACCCTTTAGGAAAG-3’，反向引物5’-GGCTTCTCATAGAACAGTCC-3’；PCR 循環(huán)參數(shù)：ERCC1 rs11615：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃30 s，62 ℃36 s，72 ℃50 s，共40 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存；限制性內(nèi)切酶消化體系為PCR 產(chǎn)物10 μL，限制性內(nèi)切酶1 μL，雙蒸水7 μL，緩沖液2μL，總體積20 μL，取含ERCC1 s11615 的PCR 產(chǎn)物10 μL 與限制性核酸內(nèi)切酶BsrDI 1 μL、雙蒸水7μL、1×反應(yīng)緩沖液1.8μL、乙酰胺0.2μL，65 ℃消化16 h，4 ℃保存；（3）瓊脂糖凝膠電泳：于燒瓶中加入0.75 g瓊脂糖+25 mL 1×Tris 硼酸電泳緩沖液，微波爐中火加熱至沸騰，倒入已置好梳子的膠膜中，37 ℃放置1 h；待膠凝固后，于電泳前后槽加入1×Tris 硼酸電泳緩沖液及玻璃板，緩慢拔出梳板，調(diào)節(jié)緩沖液面，即緩沖液面高于膠面，前槽水面略高于后槽，確保緩沖液進(jìn)入所有加樣孔；吸取酶切產(chǎn)物10 μL，保證吸管垂直加樣孔，緩緩注入DNA 樣品；加樣成功后，設(shè)定電壓（120 mV）及時(shí)間（25 min），正確接通電泳槽及電源；（4）基因分型：酶切產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳分型，野生純合子型：兩個(gè)堿基突變，無(wú)酶切位點(diǎn)，僅有最長(zhǎng)片段，電泳圖僅有一條條帶；突變純合子型：兩個(gè)堿基無(wú)突變，有酶切位點(diǎn)，形成兩條條帶；雜合子型：一個(gè)堿基突變，無(wú)酶切位點(diǎn)，形成最長(zhǎng)片段，另一個(gè)堿基無(wú)突變，有酶切位點(diǎn)，形成兩個(gè)小片段，電泳圖顯示3條條帶。

參照世界衛(wèi)生組織（WHO）抗腫瘤藥物客觀療效判定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估，包含完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定、進(jìn)展等4 個(gè)等級(jí)［6］，其中完全緩解與部分緩解屬于治療有效，歸入敏感組，穩(wěn)定和進(jìn)展屬于治療無(wú)效，歸入耐藥組。

1.3 觀察指標(biāo)（1）兩組ERCC1 rs11615 多態(tài)位點(diǎn)基因型分布。（2）影響宮頸癌鉑類化療敏感性的單因素分析。（3）影響宮頸癌鉑類化療敏感性的多因素分析。（4）隨訪24 個(gè)月，不同ERCC1 rs11615 多態(tài)位點(diǎn)基因型分布中位無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過(guò)SPSS 22.0 處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，行χ2檢驗(yàn)；采用logistic 回歸模型分析宮頸癌鉑類化療敏感性的影響因素；采用Kaplan-Meier 法計(jì)算中位PFS，比較采用log-rank 分析。P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組ERCC1 rs11615 多態(tài)位點(diǎn)基因型分布103 例宮頸癌病人經(jīng)連續(xù)化療1～2 周期后，20 例為完全緩解，51例部分緩解，23例穩(wěn)定，9例進(jìn)展，總有效率為68.93%（71/103），根據(jù)化療效果分為敏感組（n=71）和耐藥組（n=32）。敏感組ERCC1 rs11615位點(diǎn)CT 基因型高于耐藥組，且攜帶ERCC1 rs11615 位點(diǎn)CT基因型的宮頸癌病人化療耐藥的風(fēng)險(xiǎn)低于CC基因型（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組宮頸癌病人切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ERCC1）rs11615位點(diǎn)基因型分布/例（%）

2.2 影響宮頸癌鉑類化療敏感性的單因素分析臨床分期Ⅳ期、ERCC1rs11615 位點(diǎn)CC 基因型、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、深間質(zhì)浸潤(rùn)、低分化程度與宮頸癌鉑類化療敏感性密切相關(guān)（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 影響宮頸癌鉑類化療敏感性的單因素分析/例（%）

2.3 影響宮頸癌鉑類化療敏感性的多因素分析以宮頸癌鉑類化療敏感性為因變量，以臨床分期Ⅳ期、ERCC1rs11615 位點(diǎn)基因型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、間質(zhì)浸潤(rùn)、分化程度為自變量，納入logistic 回歸分析模型，結(jié)果顯示，臨床分期Ⅳ期、ERCC1 rs11615 位點(diǎn)CC基因型、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、深間質(zhì)浸潤(rùn)、低分化程度是影響宮頸癌鉑類化療敏感性危險(xiǎn)因素（P<0.05）。見(jiàn)表3，4。

表3 宮頸癌鉑類化療敏感性影響因素賦值

2.4 不同ERCC1 rs11615 位點(diǎn)基因分布中位PFS隨訪24 個(gè)月，ERCC1 基因rs11615 位點(diǎn)CC 基因型病人中位PFS 為9.8 個(gè)月，CT 基因型病人中位PFS為10.9個(gè)月，log-rank分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.76）。見(jiàn)圖1。

圖1 不同切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ERCC1）基因分布中位無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）

表4 影響宮頸癌鉑類化療敏感性的多因素分析

3 討論

在中國(guó)，宮頸癌每年新發(fā)病例14 萬(wàn)，約占全球?qū)m頸癌新發(fā)病例28.8%，且呈年輕化趨勢(shì)進(jìn)展，因此治療方面已由經(jīng)典手術(shù)、放療演變?yōu)橐苑呕?、手術(shù)為主的綜合治療［7-9］。新輔助化療已被證實(shí)是行之有效手段，其中鉑類藥物為廣譜抗癌藥物，可通過(guò)形成DNA 加合物，抑制腫瘤細(xì)胞RNA 及蛋白質(zhì)合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，減少宮旁浸潤(rùn)，增加手術(shù)徹底性機(jī)會(huì)，然而鉑類化療會(huì)引起DNA 損傷，產(chǎn)生化療耐藥［10-11］。

目前臨床認(rèn)為，機(jī)體對(duì)鉑類藥物耐受與DNA 損傷修復(fù)、藥物失活、藥物蓄積等多種因素有關(guān)，DNA損傷修復(fù)可能是其中最重要因素［12-13］。亦有學(xué)者指出，DNA 修復(fù)基因過(guò)表達(dá)可改變DNA 修復(fù)能力，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及化療藥物耐藥［14］。ERCC1 基因是DNA 損傷識(shí)別及修復(fù)重要組成部分，其單核苷酸多態(tài)性可能對(duì)宮頸癌病人鉑類耐藥及預(yù)后產(chǎn)生影響，雖然當(dāng)前已有ERCC1 基因rs11615 位點(diǎn)C/T 多態(tài)性與宮頸癌病人鉑類超敏反應(yīng)相關(guān)研究，但研究結(jié)果尚不統(tǒng)一，張龍等［15］認(rèn)為，ERCC1 基因rs11615 位點(diǎn)TT基因型能增加患宮頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)，而CC、CT基因型與宮頸癌發(fā)生無(wú)明顯關(guān)系。有研究指出，RCC1基因rs11615位點(diǎn)C/T基因型化療敏感率高于C/C基因型，且攜帶C/T基因型化療敏感性比C/C基因型增加4.48 倍［16］。分析兩者產(chǎn)生差異原因可能與遺傳背景、地區(qū)不同有關(guān)。本研究顯示，敏感組ERCC1 rs11615 位點(diǎn)CT 基因型高于耐藥組，且攜帶ERCC1 rs11615位點(diǎn)CT 基因型的宮頸癌病人化療耐藥的風(fēng)險(xiǎn)低于CC 基因型（P<0.05），故推測(cè)ERCC1 基因可能作為評(píng)估宮頸癌病人鉑類超敏反應(yīng)指標(biāo)，為宮頸癌新輔助化療提供新思路。同時(shí)本研究中并未發(fā)現(xiàn)ERCC1 rs11615 位點(diǎn)TT 基因型，考慮為樣本量偏少所致，仍需在擴(kuò)大樣本量基礎(chǔ)上繼續(xù)研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，臨床分期Ⅳ期、ERCC1 rs11615 CC基因型、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、深間質(zhì)浸潤(rùn)、低分化程度是影響宮頸癌鉑類化療敏感性危險(xiǎn)因素（P<0.05）。既往研究指出，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤預(yù)后重要因素，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多，預(yù)后相對(duì)愈差，轉(zhuǎn)移數(shù)目越少，預(yù)后相對(duì)愈好［17］。分化程度越低，提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率越高，病情越嚴(yán)重，治療效果越差，越容易產(chǎn)生耐藥。而臨床分期越低提示病情尚處于較早階段，接受以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案治療后效果更加明顯，預(yù)后越好。同時(shí)ERCC1 rs11615 CC 基因型是影響宮頸癌鉑類化療敏感性的又一危險(xiǎn)因素，亦從側(cè)面說(shuō)明鑒別診斷ERCC1 基因型分布是臨床評(píng)估宮頸癌鉑類化療敏感性的重要指標(biāo)。此外，梁軍等［18］研究發(fā)現(xiàn)，ERCC1及XRCC1基因多態(tài)性與中國(guó)晚期大腸癌病人接受奧沙利鉑一線化療后生存期有關(guān)。有學(xué)者指出，晚期非小細(xì)胞肺癌病人ERCC1基因型與中位PFS 無(wú)顯著相關(guān)性［19-20］。在此基礎(chǔ)上，本研究比較宮頸癌病人不同ERCC1 rs11615 位點(diǎn)基因分布中位PFS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERCC1 rs11615 多態(tài)位點(diǎn)CC、CT基因型的中位PFS比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上述研究結(jié)果存在一定差異，分析原因可能與腫瘤類型、ERCC1 基因位點(diǎn)及隨訪時(shí)間有關(guān)。同時(shí)受研究性質(zhì)局限，鉑類藥物出現(xiàn)耐藥后處理方案并不統(tǒng)一，且病例數(shù)較少，無(wú)法進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估，尚需嚴(yán)格長(zhǎng)期隨訪，以便更好了解鉑類藥物超敏反應(yīng)對(duì)宮頸癌病人預(yù)后的影響。

綜上，宮頸癌病人鉑類超敏反應(yīng)與ERCC1 rs11615基因型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等因素有關(guān)，建議臨床重點(diǎn)觀察上述指標(biāo)，為宮頸癌鉑類化療超敏反應(yīng)鑒別診斷提供指導(dǎo)依據(jù)。