基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的分子對(duì)接虛擬篩選JAK3特異性抑制劑

萬(wàn)祥宏，蔡沐彬，游清徽

江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330022

Janus激酶(Janus kinase，JAKs)屬于細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶家族，由JAK1、JAK2、JAK3和TYK2四個(gè)成員組成，在許多細(xì)胞因子受體的信號(hào)傳遞過(guò)程中起著中樞作用[1]。通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators of transcription，STATs)啟動(dòng)下游靶基因，進(jìn)而發(fā)揮其細(xì)胞生物功能的調(diào)控作用[2]。JAK-STAT信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等重要生物學(xué)過(guò)程均有參與，JAK-STAT信號(hào)通路的異常激活會(huì)加速癌細(xì)胞的增殖過(guò)程，例如急性早幼粒細(xì)胞白血病，其細(xì)胞系HT93A誘導(dǎo)分化時(shí)就會(huì)激活JAK-STAT，導(dǎo)致其增殖加快[3]。JAK-STAT通道還會(huì)被NADPH氧化酶激活，使得肝X受體的表達(dá)水平下降，大大影響了ATP三磷酸腺苷結(jié)合盒(AB-CA1)的表達(dá)，抑制THP-1泡沫細(xì)胞膽固醇的排出，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病[4]。目前醫(yī)藥領(lǐng)域與之相關(guān)的研究多集中于癌癥、炎癥和心血管疾病，其中炎癥性疾病主要包括潰瘍性結(jié)腸炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及克羅恩病等。

JAK蛋白作為人體中重要的一種蛋白，靶點(diǎn)JAK蛋白設(shè)計(jì)的小分子抑制劑有許多，然而大多數(shù)由于口服生物利用率低、選擇性差等缺點(diǎn)都處于臨床的不同研究階段，獲得監(jiān)管部門(mén)批準(zhǔn)的上市JAK抑制劑迄今為止僅有兩個(gè)[5]。托法替尼(tofacitinib)是美國(guó)輝瑞公司研發(fā)的一種新型的JAK1/3抑制劑，于2012年11月6日獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，之后于2013年3月25日獲得日本PMDA批準(zhǔn)上市。托法替尼作為第一代JAK抑制劑，通過(guò)抑制細(xì)胞質(zhì)受體的下游信號(hào)來(lái)阻斷細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]，達(dá)到干擾JAK-STAT信號(hào)通路從而影響DNA轉(zhuǎn)錄的目的，在抗增殖和抗炎癥方面發(fā)揮了明顯的作用。雖然該藥物已經(jīng)在臨床上得到廣泛應(yīng)用，療效較好，但是在對(duì)疾病有效的同時(shí)，也產(chǎn)生了不良反應(yīng)，包括但不限于腸胃不適、惡心、嘔吐、貧血、發(fā)熱、上呼吸道感染、肝酶和血脂升高，嚴(yán)重的還可能導(dǎo)致呼吸困難。不僅如此，托法替尼與強(qiáng)效免疫抑制劑例如他克莫司，環(huán)孢素合用還有增加免疫抑制作用的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致藥物副作用加劇。

JAK3是JAK家族中唯一與細(xì)胞因子受體γc鏈相關(guān)聯(lián)的家族成員[7]。由于JAK3在細(xì)胞因子信號(hào)傳遞中具有極其重要的作用，且其僅在特定的組織中進(jìn)行表達(dá)，因而抑制JAK3活性后導(dǎo)致免疫抑制但不會(huì)引發(fā)更多的非正常生理變化，這使得JAK3成為研究免疫抑制劑的重要靶標(biāo)[8]。因此，開(kāi)發(fā)療效確切、毒副作用輕微的JAK3抑制劑類藥物的需求仍十分迫切。通過(guò)分子對(duì)接虛擬篩選與托法替尼具有相似結(jié)合位點(diǎn)的中草藥成分小分子，有望獲得JAK3特異性抑制劑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 JAK蛋白

JAK家族中的四種蛋白的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來(lái)自RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)，JAK1、JAK2、JAK3和TYK2蛋白的PDB ID分別為6SM8、3FUP、3LXK和3LXN。所有結(jié)構(gòu)都是具有藥物結(jié)合的復(fù)合體，其中3FUP、3LXK和3LXN結(jié)合的是藥物托法替尼。

PDB ID為6SM8和3FUP的蛋白是同源多聚體，只保留結(jié)構(gòu)最完整的A鏈。

1.1.2 中草藥成分小分子

中草藥成分小分子結(jié)構(gòu)文件從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcmspw.com/)下載，一共有13 445種小分子，下載格式為MOL2。

1.2 研究方法

1.2.1 分子對(duì)接

分子對(duì)接是結(jié)構(gòu)生物學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵工具，通過(guò)預(yù)測(cè)出受體和配體的結(jié)合構(gòu)象和親和力來(lái)進(jìn)行小分子改造和設(shè)計(jì)分子對(duì)接[9]。常見(jiàn)的分子對(duì)接工具有AutoDock、LeDock、MOE Dock、FlexX等。

本研究利用LeDock軟件(http://www.lephar.com/)對(duì)中草藥成分小分子與JAK3進(jìn)行模擬對(duì)接。LeDock是由趙洪桃博士開(kāi)發(fā)的分子對(duì)接軟件，其優(yōu)點(diǎn)是小分子與蛋白質(zhì)對(duì)接既快速又準(zhǔn)確[10]。

對(duì)接盒子由GetBox-PyMol-Plugin插件(http://bioms.org/thread-1234-1-1.html)自動(dòng)識(shí)別含配體的蛋白活性空腔確定。

1.2.2 圖表繪制

本研究中的表格以Excel軟件繪制，圖片由PyMOL2.3.0和Molecular Operating Environment (MOE) 2019.0102導(dǎo)出。

2 結(jié)果與分析

利用LeDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接，得到13 445種小分子與JAK3蛋白的對(duì)接結(jié)果。

2.1 對(duì)接結(jié)果的初步處理

考慮分子對(duì)接計(jì)算算法的近似性處理和配體結(jié)合蛋白時(shí)候復(fù)雜的熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)性質(zhì)導(dǎo)致很多預(yù)測(cè)結(jié)果并沒(méi)有顯示出生物活性，為控制篩選結(jié)果的假陽(yáng)性，使用配體結(jié)合效率(ligand efficiency，LE)和結(jié)合能打分值來(lái)進(jìn)行篩選[10]。對(duì)接結(jié)果以結(jié)合能打分值小于-6.0且配體結(jié)合效率大于0.4或結(jié)合能打分值小于-7.5且配體結(jié)合效率大于0.3作為范圍進(jìn)行過(guò)濾，初步篩選出118種小分子。

2.2 對(duì)接結(jié)果的進(jìn)一步處理

2.2.1 結(jié)構(gòu)篩選

由于硫酸根、磷酸根、酚羥基與蛋白質(zhì)的結(jié)合特異性差，作為藥物的副作用大，含有這些基團(tuán)的小分子不適合作為JAK3特異性抑制劑。通過(guò)查找并分析結(jié)構(gòu)，排除含有以上基團(tuán)的小分子，得到40種符合條件的分子。

2.2.2 研究相關(guān)性篩選

根據(jù)分子的編號(hào)、名稱、結(jié)構(gòu)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcmspw.com/)、藥源網(wǎng)(https://www.yaopinnet.com/)等進(jìn)行查找，選擇對(duì)相關(guān)疾病有潛在治療效果，且已經(jīng)作為藥物、保健品成分或已有制備工藝的分子，得到18種小分子進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2.3 氫鍵數(shù)目篩選

用PyMOL保存18種小分子與3LXK蛋白結(jié)合的最佳構(gòu)象，再用MOE軟件展現(xiàn)小分子與活性位點(diǎn)氨基酸殘基的相互作用，得到氫鍵數(shù)量等數(shù)據(jù)。分析對(duì)接結(jié)果，并與托法替尼進(jìn)行對(duì)比，18種小分子以及托法替尼與3LXK的對(duì)接結(jié)合能、氫鍵數(shù)量及配體效率見(jiàn)表1。

表1 18種小分子與3LXK的對(duì)接結(jié)合能、氫鍵數(shù)量及配體效率Table 1 Docking binding energy,number of hydrogen bonds,and ligand efficiency of 18 small molecules and tofacitinib with 3LXK

氫鍵是維系蛋白質(zhì)與配體分子結(jié)合穩(wěn)定性的重要作用力[11]。小分子在靶蛋白活性空腔內(nèi)與氨基酸殘基形成的氫鍵數(shù)作為反映結(jié)合能力的另一指標(biāo)，并比較采用托法替尼分子進(jìn)行對(duì)接的打分值和配體結(jié)合效率，形成氫鍵數(shù)目越多，對(duì)接打分值越低，配體效率越高，則小分子與靶蛋白的結(jié)合能力越強(qiáng)。根據(jù)數(shù)值排名得出與JAK3的結(jié)合具有優(yōu)勢(shì)的7種小分子，相關(guān)信息見(jiàn)表2。利用MOE軟件可視化配體小分子在靶蛋白活性空腔中與相關(guān)氨基酸殘基的相互作用，得到分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖1。

M1(戊二酸)與JAK3之間通過(guò)9個(gè)氫鍵相連，是所有配體分子中氫鍵數(shù)最多的。其中Leu905、Ala966、Lys830、Asn832、Asn954作為氫供體；Leu905、Asn832、Arg953、Asn954作為氫接受體。此外Leu828更是與配體分子形成pi-H鍵，使二者之間的結(jié)合更加緊密。二者之間的對(duì)接結(jié)合能更是只有-11.3 kcal/mol遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于托法替尼的-7.5 kcal/mol。

M2(葉酸)與JAK3之間共有8個(gè)氫鍵相連，其對(duì)接結(jié)合能也低于托法替尼，僅有-10.6 kcal/mol。其中Arg953、Ala966、Pro906、Lys830、Glu903、Lys830、Asp967作為氫供體；Leu905作為氫受體。

M3(斷馬錢(qián)子苷)與JAK3之間的對(duì)接結(jié)合能為-8.28 kcal/mol，其中Asp967、Ala966、Leu905、Lys830、Leu905 作為氫供體分別形成一個(gè)氫鍵，Glu 903在結(jié)合時(shí)提供了兩個(gè)氫，此外，Lys830與Leu905為氫受體，一共形成7個(gè)氫鍵。

M4(巴豆苷)與JAK3的對(duì)接結(jié)合能為-7.57 kcal/mol稍高于托法替尼與JAK3結(jié)合的結(jié)合能，其中Met902、Ala966、Arg953、Leu828作為氫供體分別形成一個(gè)氫鍵，Glu 903則在結(jié)合時(shí)提供了兩個(gè)氫，Leu905作為氫受體，一共形成7個(gè)氫鍵。

M5(2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-抗壞血酸)與JAK3的對(duì)接結(jié)合能稍高于托法替尼的結(jié)合能，為-7.51 kcal/mol，其中Arg953、Asp967、Asp949、Leu828作為氫供體分別形成一個(gè)氫鍵，Asn954則在結(jié)合時(shí)提供了兩個(gè)氫，Arg953作為氫受體，一共形成7個(gè)氫鍵。

M6(色胺)與JAK3的對(duì)接結(jié)合能為-8.14 kcal/mol，其中Ala966、Glu 903、Asn954作為氫供體分別形成1個(gè)氫鍵，Arg953在結(jié)合時(shí)提供了兩個(gè)氫，此外，Asn954、Asp967為氫受體，一共形成6個(gè)氫鍵。

M7(仙人掌黃質(zhì)-1)與JAK3的對(duì)接結(jié)合能為-8.09 kcal/mol，Ala966、Leu828、Glu903、Lys830作為氫供體分別形成一個(gè)氫鍵，Asp967則在結(jié)合時(shí)提供了個(gè)氫，一共形成6個(gè)氫鍵。

分析小分子與JAK3蛋白的結(jié)合效果，反映其被篩選作為苗頭化合物對(duì)JAK3的抑制作用，并且發(fā)現(xiàn)JAK3蛋白活性位點(diǎn)處氨基酸殘基中，Arg953、Asp967、Lys830、Ala966和Asn954最容易與小分子配體的H、O原子形成氫鍵作用。這些氨基酸殘基在與小分子結(jié)合時(shí)發(fā)揮較為重要的作用，尤其以Arg953和Ala966與小分子配體形成氫鍵的機(jī)會(huì)最大，此外范得華力和靜電相互作用等非鍵相互作用在酶活性中心與小分子配體形成穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象中也起了非常重要的作用[13]。

表2 7種優(yōu)勢(shì)小分子的相關(guān)信息Table 2 Related information of 7 best small molecules

2.3 高選擇性篩選

為使小分子能與JAK3蛋白較好結(jié)合的同時(shí)，減小對(duì)其他JAK家族蛋白的影響，進(jìn)行相應(yīng)的高選擇性篩選。以JAK1、JAK2、TYK2為靶蛋白，將M1～M7這7種小分子分別與這三個(gè)蛋白對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)表3，篩選出僅與JAK3對(duì)接效果好，與其他JAK3家族蛋白對(duì)接效果差的小分子，從而獲得JAK3激酶的高選擇性抑制劑。

表3 7種小分子與JAK1、JAK2、TYK2的對(duì)接結(jié)合能及配體效率Table 3 Docking binding energy and ligand efficiency of 7 small molecules with JAK1,JAK2 and Tyk2

續(xù)表3(Continued Tab.3)

圖1 小分子與JAK3蛋白的分子對(duì)接圖Fig.1 Molecular docking diagram of small molecules and JAK3 protein注：A～H分別為戊二酸、葉酸、斷馬錢(qián)子苷、巴豆苷、2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-抗壞血酸、仙人掌黃質(zhì)-I和托法替尼與JAK3蛋白的分子對(duì)接圖。Note: A～H are the molecular docking respectively picture of glutaric acid,folic acid,secologanin,crotonoside,2-O-(β-D-glucopyranosyl)-ascorbic acid,tryptamine,vulgaxanthin-I,tofacitinib and JAK3 protein.

以對(duì)接打分值小于-7.5且配體結(jié)合率大于0.3作為小分子與靶蛋白對(duì)接效果好的大致標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)M6與三個(gè)靶蛋白對(duì)接效果好；M1、M2、M7與兩個(gè)靶蛋白對(duì)接效果好(其中M1、M2與JAK1和TYK2對(duì)接效果好，M7與JAK1和JAK2對(duì)接效果好)；M4、M5只與其中一個(gè)靶蛋白對(duì)接效果好，對(duì)應(yīng)分別是JAK2、TYK2蛋白。最終，只有M3(斷馬錢(qián)子苷，secologanin)與三個(gè)靶蛋白對(duì)接效果差，展現(xiàn)其與JAK3蛋白的高選擇性結(jié)合(見(jiàn)圖2)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證斷馬錢(qián)子苷的高選擇性，在參考軟件算法輔助打分的基礎(chǔ)上，利用MOE軟件，展現(xiàn)活性空腔內(nèi)小分子與周?chē)被釟埢南嗷プ饔茫⒔柚鋜eport功能，得到各氫鍵的作用力大小，驗(yàn)證可得：相比于其他JAK家族蛋白，斷馬錢(qián)子苷在JAK3蛋白活性空腔內(nèi)，與周?chē)被釟埢a(chǎn)生更多更強(qiáng)的氫鍵作用力，更穩(wěn)定地結(jié)合在其中，證實(shí)了它對(duì)JAK3蛋白高選擇性的抑制作用。

3 討論與結(jié)論

以上對(duì)接結(jié)果顯示，中草藥成分小分子戊二酸(glutaric acid)、葉酸(folic acid)、斷馬錢(qián)子苷(secologanin)、巴豆苷(crotonoside)、2-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-抗壞血酸(2-O-(β-D-glucopyranosyl)-ascorbic acid)、色胺(tryptamine)、仙人掌黃質(zhì)- I(vulgaxanthin- I)與JAK3激酶的結(jié)合能力強(qiáng)于托法替尼(Tofacitinib)，可以作為候選的JAK3激酶抑制劑。對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行匯總分析發(fā)現(xiàn)，JAK3激酶活性空腔中的Arg953、Asp967、Lys830、Ala966和Asn954氨基酸殘基容易與小分子抑制劑的H、O原子形成氫鍵作用，是JAK3抑制劑的開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。

在7種小分子中，斷馬錢(qián)子苷(secologanin)與其他JAK家族蛋白對(duì)接結(jié)合效果差，表現(xiàn)出與JAK3蛋白結(jié)合的高選擇性，有進(jìn)一步研究設(shè)計(jì)成為JAK3激酶特異性抑制劑的價(jià)值。斷馬錢(qián)子苷存在于金銀花[15]和馬錢(qián)子等植物中。金銀花(LoniceraeJaponicaeFlos)是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降血糖血脂、消炎、解熱等功效[15]，藥用歷史悠久，臨床用途十分廣泛；馬錢(qián)子(Strychnosnux-vomicaL.)被研究發(fā)現(xiàn)能夠影響與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病有關(guān)的JAK-STAT通路[16]。根據(jù)本研究的結(jié)果，斷馬錢(qián)子苷可能具備與托法替尼類似的藥理機(jī)制，通過(guò)與JAK3蛋白結(jié)合，抑制JAK磷酸化，進(jìn)而抑制STAT磷酸化，從而阻斷JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制多種炎癥細(xì)胞因子的合成與分泌，達(dá)到抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用[17]。托法替尼對(duì)JAK1和JAK3激酶都能發(fā)揮抑制作用，而斷馬錢(qián)子苷與JAK3的結(jié)合作用具有高度選擇性，作為JAK3激酶抑制劑的特異性更強(qiáng)。此外，斷馬錢(qián)子苷還是金銀花等常用中藥的成分，具有綠色性、易獲取、毒副作用小等特點(diǎn)，值得作為JAK3特異性抑制劑進(jìn)行深入研究。

圖2 斷馬錢(qián)子苷與JAK3的相互作用Fig.2 The interaction between secologanin and JAK3