川芎莖葉中苯酞類化學(xué)成分研究

唐 飛，閆洪玲，楊 麗，孫家宜，胡昌江,，彭 成，敖 慧*，譚玉柱*

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，成都 611137；3四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司 國(guó)家中醫(yī)藥管理局“中藥配方顆粒質(zhì)量與療效評(píng)”重點(diǎn)研究室，彭州 611930

川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，為著名的川產(chǎn)道地藥材，具有活血祛瘀、行氣解郁、祛風(fēng)止痛的功效，臨床用于治療頭痛、肝郁氣滯證以及多種淤血證[1]。然其傳統(tǒng)藥用部位為干燥根莖，而占全株鮮重的75%的地上部位(莖葉)多廢棄，不僅造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，且不利于中藥資源的可持續(xù)利用。川芎莖葉古稱蘼蕪，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“主咳逆、定驚氣、辟邪惡、除蠱毒、鬼痊、去三蟲、久服通神”，在川芎主產(chǎn)區(qū)四川都江堰、彭州一帶都有民間食用川芎嫩葉的習(xí)慣，以預(yù)防心腦血管疾病。其中，苯酞類化合物作為川芎的主要活性成分，對(duì)心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)等具有明顯調(diào)節(jié)作用，有研究推測(cè)其為川芎治療瘀血證或是心腦血管疾病的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[2]。而血管擴(kuò)張是目前用于冠心病、心絞痛以及心肌梗死等心血管疾病的主要治療方式，已有研究表明藁本內(nèi)酯，洋川芎內(nèi)酯A具有舒張血管活性[2]。因此，考察苯酞類成分的血管舒張活性對(duì)明確川芎及其地上部位的功效應(yīng)用都具有重要意義。

課題組前期從川芎莖葉中首次發(fā)現(xiàn)了能舒張血管的苯酞類成分[2]，本文在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步挖掘其中的苯酞類成分，研究其血管舒張作用及其初步機(jī)制，并探討了構(gòu)效關(guān)系。本文進(jìn)一步豐富了川芎莖葉苯酞類成分庫(kù)，初步探討了苯酞類成分血管舒張作用的構(gòu)效關(guān)系，為川芎及其地上部位的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Avance 400 MHz超導(dǎo)核磁共振儀，Avance 600 MHz超導(dǎo)核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)；Synapt G2 HDMS質(zhì)譜儀(Waters公司)；X-ray(APEX-IICCD,Bruker SMART公司)；Perkin-Elmer 341 plus旋光測(cè)定儀(美國(guó)Perkin Elmer公司)；LC50型中高壓制備液相(賽譜銳思北京科技有限公司)；色譜柱(COSMOS，Choiester，10ID×250 nm，5 μm；CHIRALPAKIC(LotNO.IC00CE-XC014)column(250 mm×4.6 mm，5 μm))；FA2004B電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)(PL3508B6/C-V Panlab 8 Chamber Organ Bath System)；凈化工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(15AC,SANYO公司)；高速低溫離心機(jī)(Biofuge 28RS，Heraeus Sepa Tech公司)；顯微鏡(IX71/AE31EF INV,Olympus(Japan)/Motic(China))；優(yōu)普UPT系列超純水(成都優(yōu)普電子產(chǎn)品有限公司)；可調(diào)式移液器(Thermo Fisher Scinentific)。

Sephadex LH-20色譜填料(瑞士Pharmacia公司)；MCI樹脂(日本三菱化學(xué)公司)；硅膠GF254薄層板、200～300目柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)；色譜純甲醇、正己烷、異丙醇(美國(guó)TEDIA公司)；氘代試劑(美國(guó)CIL公司)。其他試劑為分析純(成都市科隆化學(xué)品有限公司)；硝苯地平(Nifedipine，NF，美國(guó)SIGMA公司)。Fluo-3AM(10μg，索萊寶)；激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)(Olympus，Tokyo，Japan)；胎牛血清(10099-141500ml，GIBCO公司)。

SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄均可，體質(zhì)量200～240 g，由四川成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(川)2015-030。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，晝夜光照及通風(fēng)環(huán)境自然調(diào)節(jié)。A10大鼠平滑肌細(xì)胞購(gòu)自北京愛思益普生物科技股份有限公司。

川芎莖葉于2018年4月采自四川省眉山市東坡區(qū)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)胡昌江教授鑒定為川芎L.chuanxiong的莖葉，標(biāo)本CX20180402現(xiàn)存于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)1001研究室。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離

取自然陰干的川芎莖葉(20 kg)粉碎成粗粉，用95%乙醇滲漉提取，減壓濃縮成浸膏。采用系統(tǒng)溶劑法萃取得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位。取石油醚部位(0.5 kg)過(guò)MCI色譜柱(90%甲醇/水，V/V)脫色素處理，濃縮液過(guò)硅膠柱(200～300目)，石油醚/乙酸乙酯(99∶1→1∶99，V/V)梯度洗脫，分別得到組分A～F。C組分用硅膠柱(正己烷/丙酮99∶1→1∶99，V/V)梯度洗脫，得C1～C6。C3經(jīng)HPLC(75%甲醇/水，2 mL/min，V/V)制備得到化合物3(5 mg，tR=17.5 min)。C1經(jīng)HPLC(60%甲醇/水，2 mL/min，V/V)制備得到化合物12(6 mg，tR=6.78 min)、13(6 mg，tR=8.28 min)。D組分用正己烷/丙酮(80∶1→1∶99，V/V)梯度洗脫，得D1～D4。D3經(jīng)HPLC(甲醇/水70%→99%，2 mL/min，V/V)粗化段得D3.1～D3.4。D3.2經(jīng)HPLC(65%甲醇/水，2 mL/min，V/V)制備得到化合物4(6 mg，tR=8.26 min)、6(5 mg，tR=11.18 min)，D3.3經(jīng)HPLC(70%甲醇/水，2 mL/min，V/V)，制備薄層板(石油醚/乙酸乙酯2∶1)制備得到化合物8(4 mg)。D4經(jīng)HPLC(甲醇/水70%→99%，3 mL/min，V/V)得化合物1(5 mg，tR=28.22 min)，15(3.2 mg，tR=32.24 min)。E經(jīng)凝膠色譜柱(二氯甲烷/甲醇4∶6)，得E1～E5。E4經(jīng)HPLC(70%甲醇水，3 mL/min)制備得到化合物5(4 mg，tR=10.02)、9(4 mg，tR=18.46)。E5經(jīng)HPLC(70%甲醇/水，3 mL/min)制備得到化合物7(9 mg，tR=14.28 min)。F組分用正己烷/丙酮(99∶1→1∶99，V/V)梯度洗脫，得F1～F8，F(xiàn)3經(jīng)中壓C18柱(甲醇/水70%→99%，8 mL/min，V/V)梯度洗脫，得F3.1～F3.3。F3.2～F3.3經(jīng)HPLC(70%甲醇/水，2 mL/min，V/V)分別制備得到化合物10(6 mg，tR=28.64 min)、11(5 mg，tR=32.48 min)；F7、F8經(jīng)HPLC(65%甲醇/水，2 mL/min，V/V)制備得到化合物14(4 mg，tR=13.26 min)，2(4 mg，tR=18.66 min)。化合物1采用手性柱(Lot NO.IC00CE-XC014；4.6 μm，250 mm×4.6 mm)進(jìn)一步分離(208 nm，正己烷/異丙醇(90∶10)，0.8 mL/min，V/V)，得到1a和1b。

1.2.2 血管舒張實(shí)驗(yàn)

大鼠頸椎脫臼處死打開胸腔取出胸主動(dòng)脈，剪成約4 mm長(zhǎng)的血管環(huán)置于O2飽和的4 ℃K-H液(NaCl 6.92，KCl 0.35，CaCl20.28，KH2PO40.16，MgSO40.14，NaHCO32.00,Glucose 1.82，EDTA 0.009 g/L)，37 ℃恒溫。連接離體組織灌流模型和Power Lab數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，調(diào)節(jié)靜息張力為1 g，持續(xù)通入94.6%O2+5.4%CO2的混合氣體，每隔15 min更換K-H液，重復(fù)2次，平衡60 min后，用KCl(60 mM)刺激血管環(huán)，張力達(dá)坪值用K-H液沖洗3次，每次間隔5 min，恢復(fù)到基礎(chǔ)狀態(tài)后，穩(wěn)定30 min，重復(fù)刺激2次。待第3次預(yù)收縮血管環(huán)達(dá)坪值并穩(wěn)定后，浴槽內(nèi)累積加入2.4～12 μM樣品，體積共2 μL，空白組加入等體積DMSO[2]。以硝苯地平(NF)作為陽(yáng)性藥對(duì)照，記錄受試化合物對(duì)血管的舒張效應(yīng)曲線。

1.2.3 化合物15對(duì)A10血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

使用 Fluo-3 AM(5 μM)熒光探針為Ca2+指示劑，激光共聚焦顯微鏡測(cè)量[Ca2+]c的變化。將A10大鼠血管平滑肌細(xì)胞以1×105/mL的密度接種到直徑為20 mm的共聚焦小皿中，接種體積為1 mL，細(xì)胞搖勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用無(wú)鈣HBSS液清洗3次，每次在培養(yǎng)箱中孵育5 min，吸走上清液之前輕輕搖晃共聚焦小皿，以確保皿中殘留的胎牛血清被完全洗掉。清洗結(jié)束后向小皿中加入1 mL含鈣HBSS液，加入100 mM KCl造模，同時(shí)給與化合物15(20 μM)，孵育30 min。孵育結(jié)束后，棄去皿中液體，用無(wú)鈣HBSS液清洗3次，每次在培養(yǎng)箱中孵育5 min，吸走上清液之前輕輕搖晃共聚焦小皿，以確保皿中殘留的含鈣HBSS液被洗去。向小皿中加入0.5 mL含有5 μM fluo-3/AM熒光探針的無(wú)鈣HBSS孵育細(xì)胞，孵育條件為恒溫37 ℃，避光孵育20 min，取出加入2.5 mL的無(wú)鈣HBSS液(含1%血清)，再孵育40 min。孵育結(jié)束后，棄去皿中液體，用無(wú)鈣HBSS液清洗3次，每次在培養(yǎng)箱中孵育5 min，吸走上清液之前輕輕搖晃共聚焦小皿，以確保皿中殘留的染料被洗去。上機(jī)檢測(cè)，記錄初始熒光濃度，對(duì)于每個(gè)細(xì)胞，[Ca2+]c從細(xì)胞區(qū)域內(nèi)的像素平均。在分析之前進(jìn)行背景扣除，計(jì)算給藥組和對(duì)照組的平均細(xì)胞熒光值[3,4]。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法

以KCl(60 mM)所致的最大收縮張力為100%，按照公式計(jì)算各濃度化合物對(duì)血管收縮幅度的影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用血管張力值變化反映藥物作用，單位為g。采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

血管舒張率=[(最大收縮張力-

當(dāng)前收縮張力)/最大收縮張力]×100%

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1～15結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of compounds 1-15

分子式：C24H26O4，M = 378.45，晶胞參數(shù)為a= 9.008 4(5)?，b= 9.628 4(6)?，c= 13.206 4(7)?，α= 94.233(5)°，β= 109.374(5)°，γ= 100.971(5)°，V= 1 049.20(11)?3，T= 293K，空間群為P1，Z= 2，μ(MoKα) = 0.710 73 mm-1，收集衍射點(diǎn)數(shù)為8 610，獨(dú)立衍射點(diǎn)數(shù)為4 276(Rin t= 0.015 9)，R1= 0.062 5(I>2σ(I))，wR(F2) = 0.150 4(I>2σ(I))，R1= 0.108 3(all data)，wR(F2)= 0.180 4(all data)，F(xiàn)2= 1.023。其晶體數(shù)據(jù)已上傳于劍橋晶體數(shù)據(jù)中心，編號(hào)為CCDC2011219(立體結(jié)構(gòu)見圖2)。

分子式：C24H32O4，M =384.49，晶胞參數(shù)為a=19.710(5)?，b=10.730(3)?，c=10.284(3)?，α= 90°，β= 90°，γ= 90°，V= 2 174.8(10)?3，T= 293 K，空間群為P212121，Z= 4，μ(MoKα) = 0.710 73 mm-1，收集衍射點(diǎn)數(shù)為6 758，獨(dú)立衍射點(diǎn)數(shù)為4 009(Rint= 0.081 2)，R1= 0.280 1(I>2σ(I))，wR(F2)=0.285 0(I>2σ(I))，R1=0.280 1(all data)，wR(F2)= 0.399 1(all data)，F(xiàn)2= 0.991，F(xiàn)lack參數(shù)為-4.2(10)，其晶體數(shù)據(jù)已上傳于劍橋晶體數(shù)據(jù)中心，編號(hào)為CCDC2011222。

圖2 化合物1、2單晶X射線衍射分析的分子立體結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular 3D structure of compound 1 and 2 established by single crystal X-ray diffraction analysis

2.2 舒張血管活性及構(gòu)效分析

空白組對(duì)氯化鉀(KCl)誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)收縮無(wú)明顯影響(P>0.05)，硝苯地平(NF)各濃度均能顯著舒張血管環(huán)(P<0.001)，最高濃度舒張率為118%(4 μM)。單苯酞化合物3、5、4、7、8、12、13最高濃度(12 μM)舒張率分別為42%、18%、51%、43%、44%、16%、33%(P<0.01)，苯酞二聚體化合物1、2、9、10、15最高濃度舒張率分別為65.6%、25%、17%、73%、93%(P<0.01)，化合物1、10、15的EC50分別為8.81、8.23、6.2 μM，結(jié)果見圖3a。此外，化合物1拆分后，1a、1b最高濃度舒張率分別為52.2%、46.5%；1a的EC50為11.83 μM，見圖3b。

構(gòu)效分析表明，苯酞二聚體活性顯著優(yōu)于單苯酞(如化合物1、10、15)；羥基的取代位置不同對(duì)Z-丁烯基苯酞的活性影響顯著(如化合物4、5、6)；而C-6/C-7位取代與否對(duì)藁本內(nèi)酯活性影響較小(如化合物3、7、8)；但當(dāng)羥基取代于側(cè)鏈，尤其位于端基時(shí)對(duì)活性影響最大(如化合物12、13)；化合物1活性消旋體>左旋體>右旋體。

2.3 化合物15降低A10血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度

為了進(jìn)一步探究其機(jī)制，選取血管舒張活性最優(yōu)的化合物15，探究其對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣離子濃度影響。結(jié)果表明，化合物15在測(cè)試濃度下(20 μM)能顯著降低A10血管平滑肌細(xì)胞的熒光值(P<0.001)(見圖4)。其中，對(duì)照組熒光值為148，給藥組的熒光值為18。

3 討論與結(jié)論

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)心血管疾病患者已達(dá)到2.9億人，居全球首位。目前治療心血管疾病的主要手段是藥物治療，比如血管擴(kuò)張劑。通過(guò)促使血管擴(kuò)張，改善血流動(dòng)力效應(yīng)，不僅可用于高血壓的治療，同時(shí)也是治療心腦血管疾病的重要手段。血腦屏障是影響腦血管疾病治療的主要因素，有研究表明苯酞類藥物可透過(guò)血腦屏障[17,18]，這可能是川芎“上行頭目”尤善于治療頭痛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。已有研究表明，洋川芎內(nèi)酯A，藁本內(nèi)酯能夠舒張KCl引起的血管收縮(pD24.42、4.43)[19,20]，且無(wú)內(nèi)皮依賴性。藁本內(nèi)酯作為其主要苯酞類成分，由于其不穩(wěn)定限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。因此，其衍生物也應(yīng)受到更多的關(guān)注[21,22]。

圖3 受試化合物的血管舒張率Fig.3 Vasodilation rate of test

圖4 A10平滑肌細(xì)胞熒光值Fig.4 The fluorescence of A10 smooth muscle 注：與對(duì)照組相比，***P<0.001。Note:Compared with control group,***P<0.001.

本實(shí)驗(yàn)從川芎莖葉石油醚部位分離出15個(gè)苯酞類化合物，包括9個(gè)單苯酞，6個(gè)苯酞二聚體。其中，當(dāng)歸內(nèi)酯A(1)、新二聚藁本內(nèi)酯(15)、茶芎內(nèi)酯D(2)、Z-6-羥基-7-甲氧基-藁本內(nèi)酯(8)、(3S，3aR)-3-羥乙基-3a，4，5，6-四氫苯酞(12)、(3S，3aR，10R)-(-)-10-羥基苯酞(13)為首次從川芎中分離；并首次對(duì)化合物1、2進(jìn)行了單晶衍射，進(jìn)一步確定其結(jié)構(gòu)。本文簡(jiǎn)要分析了羥基取代、旋光異構(gòu)對(duì)苯酞血管舒張作用的影響，為下一步繼續(xù)豐富苯酞結(jié)構(gòu)類型，深入研究構(gòu)效關(guān)系提供參考，也為尋找新穎血管舒張劑先導(dǎo)化合物提供了方向。前期機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，藁本內(nèi)酯的活性與抑制電壓依賴性鈣通道(VDCC)和受體操作鈣通道(ROCC)介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流和釋放有關(guān)，并推測(cè)其可能與L型電壓門控鈣通道Cav1.2靶點(diǎn)有關(guān)[19,20]。本文通過(guò)激光共聚焦實(shí)驗(yàn)，初步驗(yàn)證了苯酞類成分血管舒張作用可能是通過(guò)影響離子通道開放抑制鈣離子內(nèi)流引起，但是具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。通過(guò)對(duì)川芎地上生物資源的化學(xué)成分研究，進(jìn)一步豐富了川芎莖葉的化學(xué)成分庫(kù)，為擴(kuò)血管苗頭化合物發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)，為民間食用川芎嫩葉預(yù)防心腦血管疾病提供科學(xué)依據(jù)。

致謝：感謝四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司的馮健、龐家鵝、賈麗娟、張莎莎等人在樣品采收前處理及耗材采購(gòu)中提供的幫助，在此致謝！