煙管頭草的化學(xué)成分及其細(xì)胞毒活性

馮樹慧，張衛(wèi)青，孫 茂，郭洪位，孫貴萍，朱成光，王天元*，晏 晨*

1貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽 550002；2安順市人民醫(yī)院，安順 561000

煙管頭草(Carpesiumcernuum)為菊科(Asteraceae)天名精屬(CarpesiumL.)多年生草本，主要分布在東北、華北、華中、華東、華南、西南各省及西北陜西、甘肅等地，特別是我國(guó)四川、貴州等山區(qū)資源豐富，生于路邊荒地及山坡、溝邊等處。煙管頭草在民間用于治療帶狀皰疹、流行性腮腺炎、口腔糜爛、三叉神經(jīng)痛、毛囊炎、扁平疣、流行性急性病毒性結(jié)膜炎、毒蛇咬傷等疾病[1]。天名精屬植物中主要含有倍半萜、單萜、二萜、三萜、酚類、黃酮類、香豆素、木脂素、甾體等類型的化合物[2,3]。其中以倍半萜類化合物最具代表性，也是該屬植物中報(bào)道最多且廣泛存在的成分[4-6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，該屬植物具有抗腫瘤、抑菌、抗炎、殺蟲和細(xì)胞毒活性等藥理作用[7]。前期本課題組對(duì)煙管頭草進(jìn)行了化學(xué)成分研究，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)新的倍半萜類化合物[8,9]，并對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行抗白血病[9]、抗前列腺癌[10-12]等活性研究，結(jié)果表明它們可通過抑制相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖。為了獲得生物活性更好的化合物，本課題對(duì)煙管頭草95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物繼續(xù)進(jìn)行化學(xué)成分研究，并對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行細(xì)胞毒活性測(cè)試，為天名精屬植物的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

INOVA-400 MHz和INOVA-500 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀(美國(guó)瓦里安公司)，TMS為內(nèi)標(biāo)；Waters 1525 EF高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，Waters 2998檢測(cè)器，Waters SunFire色譜柱為C18(10 mm×250 mm，4.6 mm×150 mm)；JASCO P-1020旋光儀(日本JASCO公司)；Shimadzu UV-2401A紫外光譜儀(日本Shimadzu公司)；Bruker Tensor-27紅外光譜儀(德國(guó)Bruker公司)；Bruker HCT/Esquire和Waters Autospec Premier P776質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司，美國(guó)Waters公司)；Sephadex LH-20(日本三菱化學(xué)公司)；RP-18反相硅膠(日本YMC公司)；柱層析硅膠(200～300目和300～400目，青島海洋化工廠)；硅膠GF254薄層板(50 mm×100 mm，0.20～0.25 mm，青島海洋化工廠)；分析純?nèi)燃淄?、丙?重慶川東化工集團(tuán)有限公司)；其余試劑均從工業(yè)級(jí)蒸餾中獲得；5%硫酸乙醇顯色劑。

實(shí)驗(yàn)所用煙管頭草藥材于十月份采自貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為煙管頭草(Carpesiumcernuum)，標(biāo)本(Assrmyy201608)保存于貴州省安順市人民醫(yī)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取與分離

取干燥煙管頭草全草20.0 kg，粉碎，用95%的工業(yè)乙醇加熱回流提取3次(3 h/次)，將提取液合并，濃縮回收乙醇。然后加水使?jié)饪s液呈懸浮狀態(tài)，乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取液與水層，乙酸乙酯萃取物960.0 g進(jìn)行硅膠柱層析(300～400目)，以石油醚-丙酮(60∶1→1∶1，V/V)梯度洗脫，得到7個(gè)餾分(Fr.1～7)。

Fr.1(133.0 g)經(jīng)正相硅膠柱(300～400目)，以石油醚-乙酸乙酯(60∶1→1∶1，V/V)梯度洗脫，得到4個(gè)亞餾分(Fr.1a～1d)。亞餾分1b(15.2 g)用Sephadex LH-20(CHCl3∶MeOH，V/V=1∶1)純化，并用正相硅膠柱(石油醚-乙酸乙酯，15∶1)進(jìn)一步純化，得到化合物2(325.6 mg)和3(95.4 mg)。亞餾分1d(2.8 g)經(jīng)正相硅膠柱(300～400目)，以石油醚-乙酸乙酯(30∶1→5∶1，V/V)梯度洗脫，并用制備型高效液相色譜(乙腈∶水，V/V=60∶40)進(jìn)一步純化，分離得到化合物1(11.6 mg)和7(8.0 mg)。Fr.2(82.4 g)經(jīng)硅膠、Sephadex LH-20、反相RP-18柱層析反復(fù)分離，并經(jīng)制備型高效液相色譜(乙腈∶水，V/V=60∶40)進(jìn)一步純化得到化合物4(42.6 mg)、5(19.2 mg)和6(8.5 mg)。Fr.3(102.0 g)經(jīng)反相RP-18柱層析，以甲醇-水系統(tǒng)(40%∶60→100∶0，V/V)梯度洗脫，再經(jīng)制備型高效液相色譜(乙腈∶水，V/V=60∶40)分離純化后得到化合物8(5.0 mg)、9(6.3 mg)和10(9.5 mg)。

1.2.2 細(xì)胞毒活性

采用MTT法對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231進(jìn)行細(xì)胞毒活性。化合物分別用DMSO溶解后配成30 mmol/L的儲(chǔ)備液，使用之前稀釋到適宜濃度。將MDA-MB-231細(xì)胞配制成細(xì)胞懸液接種于96孔板上(100 μL/孔)，實(shí)驗(yàn)分為陽性對(duì)照組和四個(gè)給藥組，接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別加入1.25、2.5、5、10 μmol/L的含藥樣品溶液各10 μL，在5% CO2，37 ℃孵育72 h后，每孔加入10 μL配制好的MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，孵育后使用酶標(biāo)儀測(cè)量在波長(zhǎng)為490 nm下的吸光度(A)，并計(jì)算IC50值。紫杉醇為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 化合物1～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-10

通過二維核磁1H-1H COSY、HSQC、HMBC譜對(duì)化合物的碳?xì)湫盘?hào)進(jìn)行了全歸屬，其詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1?；衔?的1H-1H COSY(見圖2)表明結(jié)構(gòu)中存在三個(gè)連續(xù)的片段H-3/H-4/H-5、H-7/H-8/H-9/H-10/H-17、H-17/H-10/H-11/H-12/H-13，基于1H-1H COSY片段H-3/H-4/H-5，HMBC相關(guān)H-4到C-2、3、5、6說明C-5與C-6之間為雙鍵，C-2為酮羰基；同時(shí)，C-2與H-1、3、4存在相關(guān)性，可知C-1為與C-2直接相連的甲基；結(jié)合H-7/H-8/H-9/H-10/H-17片段，由HMBC譜中H-7到C-5、6、8、9、18相關(guān)，參考DEPT譜，說明C-7/C-8/C-9為三個(gè)直接相連的亞甲基片段以及確定了C-5、6、7、18的連接方式；此外，在HMBC譜中，H-18與乙酰氧基中的酯羰基碳原子、甲基碳原子有相關(guān)，乙酰氧基中的甲基質(zhì)子與C-18有相關(guān)，可判斷乙酰氧基連接在C-18位上；根據(jù)H-17/H-10/H-11/H-12/H-13片段，由HMBC譜中H-10到C-9、11、17和H-12到C-10、11、13、14相關(guān)，說明了C-9、10、11、12、13、14、17的連接方式；H-15和H-16與C-13、C-14存在相關(guān)性，說明兩個(gè)甲基C-15、C-16與C-14直接相連。ROESY相關(guān)峰H-4/H-18及H-5/H-7表明C-5與C-6之間的雙鍵構(gòu)型為Z?；衔?的絕對(duì)構(gòu)型還有待確認(rèn)[13]?；衔?與(2E,6Z,10E,12R)-7-[(acetyloxy)methyl]-3,11,15-trimethylhexadeca-2,6,10,14-tetraene-1,12-diol的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)[14]相似，表明兩個(gè)化合物具有相似的分子骨架，兩者的區(qū)別在于化合物1比已知化合物少了2個(gè)雙鍵、1個(gè)羥基和2個(gè)亞甲基，但化合物1多了1個(gè)羰基。因此確定化合物1為(5Z)-6-[(acetyloxy)methyl]-2-oxo-2,10,14-trimethylhexadeca-5,13-diene-11α-ol?；衔?的詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費(fèi)下載(www.trcw.ac.cn)。

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)Table 1 1H (400 MHz) and 13C (100 MHz) NMR dataof compound 1 ( in CDCl3,δ in ppm,J in Hz)

圖2 化合物1的1H-1H COSY、HMBC和ROESY主要相關(guān)信號(hào)Fig.2 Key 1H-1H COSY,HMBC and ROESY correlations signal of compound 1

化合物2黃色油狀物；C22H38O4；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.41(1H，m，H-2)，5.40(1H，m，H-10)，5.17(1H，m，H-14)，4.58(2H，s，H-18)，4.13(2H，d，J= 6.8 Hz，H-1)，3.40(1H，m，H-12)，2.06(3H，s，H-2′)，1.74(3H，s，H-16)，1.66(3H，s，H-20)，1.65(3H，s，H-17)，0.90(3H，d，J= 6.8 Hz，H-19)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：59.2(C-1)，124.1(C-2)，138.4(C-3)，39.4(C-4)，25.8(C-5)，32.5(C-6)，38.0(C-7)，31.5(C-8)，25.8(C-9)，130.3(C-10)，135.2(C-11)，75.5(C-12)，35.4(C-13)，120.5(C-14)，134.1(C-15)，25.9(C-16)，17.9(C-17)，61.8(C-18)，15.4(C-19)，16.2(C-20)，171.2(C-1′)，20.9(C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物為(2E,10E)-1,12-dihydroxy-18-acetoxy-3,7,15-trime-thylhexadeca-2,10,14-triene。

化合物3黃色油狀物；C22H36O4；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.42(1H，t，J= 7.2 Hz，H-2)，5.40(1H，t，J= 6.8 Hz，H-6)，5.38(1H，t，J= 7.2 Hz，H-10)，5.08(1H，t，J= 7.2 Hz，H-14)，4.59(2H，s，H-19)，4.14(2H，d，J= 6.8 Hz，H-1)，3.97(1H，t，J= 6.4 Hz，H-12)，2.07(3H，s，H-AcO)，1.72(3H，s，H-16)，1.64(3H，s，H-17)，1.63(3H，s，H-20)，1.62(3H，s，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：59.3(C-1)，124.0(C-2)，137.2(C-3)，39.3(C-4)，26.1(C-5)，130.4(C-6)，133.6(C-7)，34.7(C-8)，25.9(C-9)，125.3(C-10)，137.3(C-11)，77.0(C-12)，34.7(C-13)，120.1(C-14)，134.7(C-15)，25.8(C-16)，18.0(C-17)，11.8(C-18)，61.9(C-19)，16.2(C-20)，20.0(CH3-AcO)，171.2(COO-AcO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物為(2E,6Z,10E,12R)-7-[(acetyloxy)methyl]-3,11,15-trimethylhexadeca-2,6,10,14-tetraene-1,12-diol。

化合物4無色油狀物；C22H38O4；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.40(1H，br t，J= 7.1 Hz，H-2)，5.38(1H，br t，J= 6.8 Hz，H-6)，5.17(1H，d，J= 6.8 Hz，H-14)，4.13(2H，d，J= 7.1 Hz，H-1)，3.40(1H，m，H-12)，2.22(2H，m，H-5)，2.12(2H，m，H-13)，2.08(2H，m，H-4)，1.99(1H，m，H-9α)，1.76(3H，brs，H-16)，1.67(3H，br s，H-20)，1.65(3H，brs，H-17)，1.55(1H，m，H-11)，1.49(1H，m，H-10α)，1.30(1H，m，H-9β)，1.13(1H，m，H-10β)，0.89(1H，d，J= 6.8 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：59.2(C-1)，124.1(C-2)，137.5(C-3)，39.3(C-4)，25.8(C-5)，130.2(C-6)，133.9(C-7)，35.4(C-8)，25.4(C-9)，31.5(C-10)，38.0(C-11)，75.4(C-12)，32.4(C-13)，120.5(C-14)，135.3(C-15)，25.9(C-16)，17.9(C-17)，15.4(C-18)，61.8(C-19)，16.1(C-20)，20.9(CH3-AcO)，171.1(COO-AcO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物為(2E,6Z,11S,12R)-3,7,11,15-tetramethylhexadeca-2,6,14-triene-7-[(acetyloxy)methyl]-1,12,19-triol。

化合物5黃色油狀物；C20H34O2；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：5.27(1H，m，H-6)，5.14(1H，m，H-14)，5.07(1H，m，H-10)，3.93(2H，d，J= 7.2 Hz，H-1)，3.90(2H，s，H-18)，1.63(6H，s，H-16，H-17)，1.57(6H，s，H-19，H-20)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：57.9(C-1)，125.2(C-2)，135.3(C-3)，39.4(C-4)，25.5(C-5)，125.4(C-6)，139.2(C-7)，34.5(C-8)，26.2(C-9)，124.2(C-10)，130.6(C-11)，39.4(C-12)，26.2(C-13)，124.1(C-14)，134.2(C-15)，25.3(C-16)，16.0(C-17)，57.5(C-18)，17.6(C-19)，15.8(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物為plaunotol。

化合物6黃色油狀物；C13H18O3；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.85(1H，d，J= 15.7 Hz，H-7)，6.48(1H，d，J= 15.7 Hz，H-8)，5.96(1H，d，J= 1.1 Hz，H-4)，2.52(1H，d，J= 17.2 Hz，H-2β)，2.33(1H，d，J= 18 Hz，H-2α)，2.31(3H，s，H-10)，1.88(3H，d，J= 1.4 Hz，H-11)，1.11(3H，s，H-13)，1.02(3H，m，H-12)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：41.4(C-1)，49.5(C-2)，197.4(C-3)，127.7(C-4)，160.3(C-5)，79.2(C-6)，144.9(C-7)，130.3(C-8)，196.9(C-9)，29.6(C-10)，18.6(C-11)，24.3(C-12)，22.9(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18,19]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物為S-(+)-dehydrovomifoliol。

化合物7白色粉末；C11H16O3；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.68(1H,S,H-6),4.32(1H,S,H-s),2.45(1H，dt，J= 14.2，2.6 Hz，H-3β)，1.98(1H，dt，J= 14.5，2.6 Hz，H-1β)，1.73-1.81(1H，m，H-3α)，1.77(3H，s，H-11)，1.51(1H，dd，J= 14.6，3.7 Hz，H-1α)，1.46(3H，s，H-9)，1.25(3H，d，J= 8.8 Hz，H-10)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：47.2(C-1)，66.6(C-2)，45.5(C-3)，86.8(C-4)，182.7(C-5)，112.7(C-6)，172.0(C-7)，35.9(C-8)，26.4(C-9)，30.61(C-10)，26.9(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20,21]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物為pubinernoid A。

化合物8白色針晶(氯仿)；mp.151～152 ℃；C29H48O；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.35(1H，m，H-6)，5.15(1H，dd，J= 15.1,8.5 Hz，H-22)，5.01(1H，dd，J= 8.8 Hz，H-23)，3.52(1H，m，H-3)，1.01(3H，s，CH3-10)，0.82(3H，s，CH3-29)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.2(C-1)，29.1(C-2)，71.8(C-3)，42.2(C-4)，140.7(C-5)，121.7(C-6)，31.8(C-7)，31.9(C-8)，50.1(C-9)，36.5(C-10)，21.1(C-11)，39.7(C-12)，42.2(C-13)，56.8(C-14)，24.2(C-15)，28.9(C-16)，55.9(C-17)，12.0(C-18)，19.4(C-19)，40.5(C-20)，21.1(C-21)，138.3(C-22)，129.2(C-23)，51.2(C-24)，31.6(C-25)，18.9(C-26)，21.0(C-27)，25.4(C-28)，12.0(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22,23]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物為豆甾醇。

化合物9白色針晶(甲醇)；mp.187～188 ℃；C27H28N2O4；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.71(2H，d，J= 7.2 Hz，H-3′，H-7′)，7.53(1H，t，J= 7.2 Hz，H-5′)，7.44(2H，t，J= 7.6 Hz，H-4′，H-6′)，7.25(5H，m，H-5，H-9)，7.15(2H，m，H-5′′，H-7′′)，7.06(2H，d，J= 7.2 Hz，H-4′′，8′′)，6.80(1H，d，J= 7.6 Hz，H-βNH)，6.05(1H，d，J= 8.4 Hz，H-αNH)，4.78(1H，dd，J= 8.0，14.0 Hz，H-2)，4.34(1H，m，H-1′′)，3.92(1H，dd，J= 4.8，11.0 Hz，H-9′′β)，3.81(1H，dd，J= 4.0，11.2 Hz，H-9′′α)，3.21(1H，dd，13.6 Hz，J= 6.0，H-3β)，3.06(1H，dd，J= 8.4，13.6 Hz，H-3α)，2.75(2H，m，H-2′′)，2.02(3H，s，-COCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：170.2(C-1)，54.9(C-2)，38.4(C-3)，136.7(C-4)，128.6(C-5，C-9)，129.3(C-6，C-8)，127.1(C-7)，167.1(C-1′)，133.6(C-2′)，128.5(C-3′，7′)，127.0(C-4′，C-6′)，131.9(C-5′)，49.4(C-1′′)，37.4(C-2′′)，136.6(C-3′′)，128.7(C-4′′，C-8′′)，129.1(C-5′′,C-7′′)，126.7(C-6′′)，64.6(C-9′′)，20.8(CH3-COCH3)，170.8(C=O-COCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24,25]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物為aurantiamide acetate。

化合物10白色針晶(甲醇)；mp.210～212 ℃；C9H8O3；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.52(1H，d，J=16.0 Hz，H-3)，7.49(2H，m，H-2′，H-6′)，6.78(2H，m，H-3′，H-5′)，6.28(1H，d，J= 16.0 Hz，H-2)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：167.9(C-1)，115.3(C-2)，125.2(C-3)，144.2(C-1′)，130.1(C-2′，C-6′)，115.7(C-3′，C-5′)，159.6(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26,27]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物為反式對(duì)羥基肉桂酸。

2.2 細(xì)胞毒活性

本實(shí)驗(yàn)對(duì)從煙管頭草中分離得到的化合物1～4進(jìn)行細(xì)胞毒活性測(cè)試，結(jié)果顯示，與陽性對(duì)照紫杉醇(taxol，IC50= 0.10 μmol/L)相比，化合物2對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，其IC50值為6.80 μmol/L，化合物1、3、4表現(xiàn)出中等細(xì)胞毒活性，IC50值分別為34.89、46.13、30.38 μmol/L。

3 討論與結(jié)論

本文從煙管頭草全株95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位共分離和鑒定出10個(gè)化合物，包括單萜類、二萜類及其他類化合物，其中化合物1為新化合物?；衔?先前被日本學(xué)者研發(fā)為抗?jié)兯幤談谥Z托，但其具體的有效部位尚未確定，提示在后期天名精屬化學(xué)成分活性研究中可以對(duì)分離得到的二萜類化合物進(jìn)行抗?jié)兯幚砘钚匝芯俊?/p>

對(duì)化合物1～4進(jìn)行細(xì)胞毒活性測(cè)試表明，化合物2對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性,其IC50值為6.80 μmol/L，化合物1、3、4表現(xiàn)出中等細(xì)胞毒活性。煙管頭草提取物對(duì)多種癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用[28]，但在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中IC50值最小，這為治療乳腺癌疾病提供了一定的藥理依據(jù)，提示煙管頭草提取物可作為抗乳腺癌藥物的潛在成分。綜合本課題組前期對(duì)煙管頭草中化學(xué)成分進(jìn)行抗白血病[9]、抗前列腺癌[10-12]研究發(fā)現(xiàn)，其單體化合物可通過抑制相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖。因此，煙管頭草在抗腫瘤方面具有很大的研究前景，但目前藥理活性的研究主要集中在單體化合物的體外活性篩選，而體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)、作用機(jī)制及構(gòu)效關(guān)系的研究甚少，可將量大的單體化合物進(jìn)行體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)，這為抗腫瘤新藥的研發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。