白藜蘆醇通過Nrf2/HO-1通路對高糖誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷的保護作用機制＊

胡 寅，崔 莎，李卓君，胡 琴，邱志方

（1.湖北文理學院附屬醫(yī)院襄陽市中心醫(yī)院 襄陽 441003；2.襄陽愛爾眼科醫(yī)院 襄陽 441003）

糖尿病性視網(wǎng)膜病變是糖尿病最重要的并發(fā)癥之一，該病可分為增殖性和非增殖性，其中增殖性已經(jīng)成為成年人致盲的主要原因[1-2]。中國是糖尿病第一大國，預計達到2030年，糖尿病性視網(wǎng)膜病變的患病率已經(jīng)高達22.4%[3]。目前全球糖尿病性視網(wǎng)膜病變已經(jīng)超過1700萬[4]，故對糖尿病性視網(wǎng)膜病變的防治具有非常重要的意義。糖尿病性視網(wǎng)膜病是與高糖相關的慢性進行性視網(wǎng)膜疾病[5]。糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率比較高，相關研究報道顯示，5年內(nèi)的糖尿病患者發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率為4.7%[6]，10年以內(nèi)發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率為7.9%[7]。糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展會引起不同程度的視覺損傷和視力減退。

糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)病變主要病理改變?yōu)樯窠?jīng)膠質(zhì)細胞增生和神經(jīng)節(jié)細胞凋亡，高糖環(huán)境下，低血流灌注會引起視網(wǎng)膜缺氧、缺血，導致神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、視網(wǎng)膜神經(jīng)水腫以及維軸漿流中斷，引起視網(wǎng)膜神經(jīng)的原發(fā)性損傷[8-9]。因此，保護高糖損傷的神經(jīng)節(jié)細胞能延緩或可減輕視網(wǎng)膜神經(jīng)變性。另外，也有研究顯示糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)病變與氧化應激損傷有關。氧化應激可以損害視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞和線粒體，導致視網(wǎng)膜缺血缺氧，加重炎癥反應，使細胞發(fā)生凋亡，最終出現(xiàn)視網(wǎng)膜出血和滲出等[10-11]。

白藜蘆醇（Resveratrol，RES）是一種天然的多酚植物抗毒素，存在于葡萄、藍莓、蔓越莓等天然植物中[12]。RES具有抗氧化活性、改善炎癥、清除自由基、延緩衰老、保護神經(jīng)和心血管的作用[13]。已有研究表明，RES對青光眼視網(wǎng)膜損傷具有一定的保護作用[14]。然而RES是否能改善高糖誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷既往少有報道。本研究用鏈脲佐菌素誘導小鼠發(fā)生糖尿病并用RES進行干預，提取小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，檢測神經(jīng)節(jié)數(shù)量及凋亡情況，并檢測氧化應激指標、核因子E2相關因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素氧合酶1（Heme oxygenase-1，HO-1）通路的變化，以期為臨床糖尿病性視網(wǎng)膜病變治療提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

野生型C57BL/6小鼠60只和Nrf2敲除的C57BL/6小鼠20只，均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。12周齡，體質(zhì)量（28±2）g，許可證號SCXK（湘）2019-0004，將野生型C57BL/6小鼠隨機分為3組：對照組、高糖組和RES組，每組20只，Nrf2敲除的C57BL/6小鼠為RES+Nrf2敲除組。

1.2 主要試劑

白黎蘆醇，購自美國Selleck，批號：L13007；RIPA蛋白裂解液，購自武漢Servicebio公司，批號：GB 21009；HE染色液，購自碧云天生物技術(shù)研究所，批號：G1016；Bax、Cleaved Caspase3、Nrf2、HO-1一抗，購自北京索萊寶科技有限公司，批號：A10036、A12013、A10017、A12073；多聚甲醛購自美國sigma公司，批號B5011；BCA蛋白試劑盒，美國Millipore，批號M0119；MDA、SOD、8-OHdG含量試劑盒，購自北京索萊寶公司，批號190314、190607、190523。

1.3 主要儀器

XSP-63XDV型倒置熒光顯微鏡（上海光學儀器）；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀）；Calibur流式細胞儀（美國BD公司）；-80℃超低溫冰箱（美國Thermo Scientific）；酶標儀（美國BioTek公司）。

1.4 方法

1.4.1 糖尿病視網(wǎng)膜病變小鼠模型構(gòu)建和藥物干預

小鼠模型的構(gòu)建和藥物干預參考Luo等[15]人的研究方法進行，高糖組和RES組、RES+Nrf2敲除組中的小鼠禁食8-10 h，按照小鼠體質(zhì)量60 mg·kg-1劑腹腔注射鏈脲佐菌素，連續(xù)注射5天后，第7天取小鼠尾部靜脈血檢測血糖，血糖＞11.1 mmol·L-1作為糖尿病成功建模的標準，對照組小鼠連續(xù)注射等量的檸檬酸緩沖液5天。再將各組小鼠連續(xù)飼喂專用飼料3個月，每個月進行1次眼底檢查，糖尿病小鼠出現(xiàn)視網(wǎng)膜出血或者新生血管，即糖尿病視網(wǎng)膜病變小鼠模型成功，對照組的小鼠給予正常飼料喂養(yǎng)。將RES溶解在25%乙醇中，然后用生理鹽水稀釋，RES組和RES+Nrf2敲除小鼠每天腹腔注射20 mg·kg-1的RES，連續(xù)注射5天，對照組小鼠注射等體積的生理鹽水，連續(xù)注射5天。

1.4.2 HE染色

將小鼠麻醉并處死，取出大鼠的部分視網(wǎng)膜組織在4%多聚甲醛中進一步固定1 h。用不同濃度的酒精作為脫水劑，逐漸去除組織塊中的水分。用二甲苯代替組織塊中的酒精，然后用蠟包埋組織，切片機取薄切片。蘇木精和伊紅溶液染色，光學顯微鏡拍照。

1.4.3 神經(jīng)節(jié)細胞提取和鑒定

按照Altmann[16]等方法提取各組小鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，小鼠麻醉處死，鈍性分離眼球，去角膜，鞏膜、玻璃體，分離獲得到視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，置于玻璃試管的木瓜蛋白酶混合溶液中。20 min后，丟棄液體，加入DMEM/F12細胞培養(yǎng)液制成懸液，調(diào)整細胞密度10×106cells·mL-1，將稀釋后的細胞懸液加入6孔板中，顯微鏡下觀察細胞濃度及細胞貼壁，將稀釋后的5-Fu和尿苷混合儲備溶液加入6孔板中，置于37℃的5%的CO2中培養(yǎng)，24 h后，棄去原培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30 min，加l mL破膜工作液，室溫孵育l0 min，PBS洗3次，滴加3%的過氧化氫溶液，避光孵育20 min，棄除3%過氧化氫溶液，滴加一抗Brn3a，4oC孵育過夜。再加CY3標記二抗，室溫孵育50 min，加入非特異性細胞核染色液DAPI染液，室溫孵育，統(tǒng)計每個視網(wǎng)膜顯微鏡視野內(nèi)的細胞數(shù)量，使用Image J軟件進行手工計數(shù)。

1.4.4 流式細胞儀檢測

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率收集各組細胞樣本，采用熒光雙染色法（Annexin V-FITC/PI）在流式細胞儀上進行細胞凋亡率檢測，PBS洗滌貼壁細胞，加入胰酶消化細胞，再加入培養(yǎng)基終止消化，用移液槍輕輕吹打細胞制成懸液，轉(zhuǎn)移至流式管，離心處理，300 r·min-1離心5 min，棄上清，加入3 mL PBS重新懸浮細胞，采用300 μL Binding Buffer重懸，在加入5 μL Annexin V-FITC和PI，避光孵育5 min，上流式細胞儀檢測。

1.4.5 氧化應激指標檢測

每組取5只小鼠分離小鼠視網(wǎng)膜組織，采用RIPA裂解液均漿，然后進行離心處理，4℃離心25 min（2500 r·min-1），按ELISA試劑盒說明書操作，檢測超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的含量。

1.4.6 Western blot檢測凋亡相關蛋白及Nrf2和Ho-1蛋白表達

每組取5只小鼠分離小鼠視網(wǎng)膜組織，采用RIPA緩沖液收集蛋白樣品，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度，使用12% SDS-PAGE在140 V電壓下分離樣品中的不同蛋白質(zhì)，然后以300 mA的電流將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入Bax（1∶500稀釋）、Cleaved Caspase3（1∶500 稀 釋）、Bcl2（1∶500 稀釋）、Nrf2（1∶1000稀釋）和HO-1（1∶1000稀釋）一抗，37℃孵育1 h，PBS緩沖液洗3次。然后，將山羊抗兔IgG（1:5000稀釋）與該膜在37℃下孵育1 h，滴加ECL混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)龋凳抑衅毓?，A1phaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.4.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0軟件統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，采用t檢驗或ANOVA檢驗。以均數(shù)±標準差（）表示，多樣本間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RES對視網(wǎng)膜組織的影響

HE染色結(jié)果顯示，高糖組的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層（GCL）和內(nèi)核層（INL）明顯的消失或減少，外核層（ONL）厚度也顯著下降。與高糖組相比，RES組可以減輕高糖誘導引起的損傷，而RES+Nrf2敲除組較RES組相比，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層（GCL）、內(nèi)核層（INL）有所減少，外核層（ONL）厚度有所降低，見圖1A。高糖組視網(wǎng)膜厚度明顯低于對照組（P＜0.01），RES組視網(wǎng)膜厚度顯著高于高糖組（P＜0.05），RES+Nrf2敲除組視網(wǎng)膜厚度相對低于RES組（P＜0.05）。見圖1B。

2.2 RES對神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量的影響

高糖組中的神經(jīng)節(jié)數(shù)量明顯低于對照組（P＜0.05），RES組中的神經(jīng)節(jié)數(shù)量明顯高于高糖組（P＜0.05），RES+Nrf2敲除組中的神經(jīng)節(jié)數(shù)量顯著低于RES組（P＜0.05），見圖2。

2.3 RES對神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的影響

高糖組中的凋亡率明顯高于對照組（P＜0.05），RES組中的凋亡率明顯低于高糖組（P＜0.05），RES+Nrf2敲除組中的凋亡率顯著高于RES組（P＜0.05），見圖3。

2.4 RES對神經(jīng)節(jié)細胞凋亡相關蛋白的影響

高糖組中的Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達明顯高于對照組（P＜0.05），RES組中的Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達明顯低于高糖組（P＜0.05），RES+Nrf2敲除組中的Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達顯著高于RES組（P＜0.05），見圖4A、4B和4C；高糖組中的Bcl2蛋白表達明顯低于對照組（P＜0.05），RES組中的Bcl2蛋白表達明顯高于高糖組（P＜0.05），RES+Nrf2敲除組中的Bcl2蛋白表達顯著低于RES組（P＜0.05），見圖4A和4D。

2.5 RES對小鼠視網(wǎng)膜氧化應激的影響

高糖組中的SOD水平明顯高于對照組（P＜0.05），RES組中的SOD水平明顯高于高糖組（P＜0.05），RES+Nrf2敲除組中的SOD水平顯著低于RES組（P＜0.05），見圖5A；高糖組中的MDA和8-OHdG水平明顯低于對照組（P＜ 0.05），RES組中的MDA和8-OHdG水平明顯低于高糖組（P＜0.05），RES+Nrf2敲除組中的MDA和8-OHdG水平顯著高于RES組（P＜0.05）。見圖5B和5C。

圖1 視網(wǎng)膜組織HE染色（×100）

圖2 RES對神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量的影響

2.6 RES對Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

高糖組中Nrf2和HO-1的蛋白表達顯著低于對照組（P＜0.05），RES組中Nrf2和HO-1的蛋白表達明顯高于高糖組（P＜0.01），RES+Nrf2敲除組Nrf2和HO-1的蛋白表達顯著低于RES組（P＜0.05）。見圖6A和6B。

圖3 RES對神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的影響

圖4 RES對神經(jīng)節(jié)細胞凋亡相關蛋白的影響

圖5 RES對小鼠視網(wǎng)膜氧化應激的影響

圖6 RES對Nrf2和Ho-1蛋白表達的影響

3 討論

3.1 高糖誘導視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷

在視網(wǎng)膜的各級神經(jīng)元中，神經(jīng)節(jié)細胞是視網(wǎng)膜中唯一參與形成視神經(jīng)纖維的神經(jīng)元，也是唯一把視網(wǎng)膜視覺信息傳遞到視覺中樞的傳出神經(jīng)元，在視覺形成中有重要作用[17]。高糖導致的神經(jīng)節(jié)細胞損傷主要與谷氨酸興奮性毒性、免疫炎癥損傷、氧化應激、線粒體功能障礙、鈣離子超載和神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏等有關[18]。本研究建立糖尿病視網(wǎng)膜病變小鼠模型，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)核層明顯消失或減少，外核層厚度也顯著下降，另外神經(jīng)節(jié)數(shù)量明顯減少。另外還發(fā)現(xiàn)，高糖可導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡明顯增加，并且出現(xiàn)氧化應激損傷。這與既往報道一致[17]。

3.2 RES對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷、凋亡及氧化應激的改善作用

現(xiàn)代藥理學研究顯示[14]，RES具有抗氧化活性、改善炎癥、清除自由基、延緩衰老、保護神經(jīng)和心血管的作用，被證實可有效抑制視網(wǎng)膜損傷。然而RES對高糖誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷的改善作用既往少有報道。本研究采用HE染色驗證RES對視網(wǎng)膜組織的影響，結(jié)果顯示RES可以減輕高糖誘導引起的損傷，增加神經(jīng)節(jié)數(shù)量，以及GCL、INL和ONL。視網(wǎng)膜損傷與氧化應激、凋亡密切相關。糖尿病可造成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突突觸功能障礙和不可逆的損傷，從而阻斷視覺信號的傳遞，導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡，最終造成視功能不可逆性損傷[19]。氧化應激可以損害視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞和線粒體，導致視網(wǎng)膜缺血缺氧，加重炎癥反應，進一步促進細胞凋亡，最終出現(xiàn)視網(wǎng)膜出血和滲出等[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，RES干預后SOD水平升高，MDA和8-OHdG水平明顯降低，同時Nrf2和Ho-1的蛋白表達明顯升高。另外Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達水平降低，而Bcl2蛋白表達水平升高，提示RES可以通過降低凋亡和氧化損傷而改善受損的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞。

3.3 RES通過Nrf2/HO-1通路發(fā)揮作用

Nrf2/HO-1通路與氧化應激密切相關，是保護機體免遭活性氧導致內(nèi)源性和外源性應激損傷的主要細胞通路，Nrf2是細胞抗氧化應激的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，當受到氧化活性物質(zhì)刺激時Nrf2和HO-1啟動子部位結(jié)合，調(diào)控下游抗氧化酶和II相代謝酶基因的轉(zhuǎn)錄活動，增強機體抗氧化能力[20]。越來越多的研究表明，Nrf2/HO-1通路在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜氧化應激反應中起著最重要的作用，比如白皮杉醇可通過激活Nrf2/HO-1通路促使糖尿病大鼠視網(wǎng)膜氧化還原狀態(tài)的恢復[21]，樺褐孔菌多糖經(jīng)Nrf2信號通路可明顯抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應激和炎癥反應[22]。RES是否可作用于Nrf2/HO-1通路，既往未見報道。但有研究發(fā)現(xiàn)[23]，RES對H2O2誘導的HaCaT細胞氧化損傷具有保護作用，而這種保護作用可能依賴于HO-1的表達。本研究敲除Nrf2基因后，RES對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的抗凋亡和抗氧化應激作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)，提示RES可能是通過Nrf2/HO-1通路發(fā)揮作用。

3.4 總結(jié)

綜上所述，RES對糖尿病性視網(wǎng)膜病變小鼠視網(wǎng)膜和神經(jīng)節(jié)細胞具有一定的保護作用，RES通過激活Nrf2和HO-1抑制氧化應激，從而抑制神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡，保護糖尿病性視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜的完整性。