基于加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析探討黃芩抗肝細(xì)胞癌的相關(guān)分子機(jī)制＊

徐玉平，譚 榮，蔣向輝

（凱里學(xué)院大健康學(xué)院 凱里 556011）

肝細(xì)胞癌（HCC）是一種死亡率很高的原發(fā)性肝癌，發(fā)病率居世界第六位，死亡率居世界第四位[1]，其在40歲前發(fā)生率較少，而后隨著年齡逐漸升高，70歲達(dá)到頂峰，男性發(fā)病率是女性的2-4倍。酒精性肝硬化、肝炎病毒感染、吸煙等是其重要的致病原因。HCC早期不易察覺，病情發(fā)展至中晚期后，常出現(xiàn)食欲減退、乏力、腹脹、肝區(qū)疼痛等癥狀，還可兼發(fā)上消化道出血、肝昏迷、肝癌破裂出血、肝腎衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥。HCC惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后轉(zhuǎn)歸較差，因此，有“癌中之王”之稱[2]。目前，肝細(xì)胞癌的治療手段有手術(shù)切除、局部消融、肝臟移植、放化療、介入栓塞術(shù)等，但存在供體有限、費(fèi)用高昂、毒副作用多、易產(chǎn)生耐藥性及腫瘤異質(zhì)性強(qiáng)[3-5]等問題。近年來很多研究表明中藥可通過多通路抗肝癌組織血管生成，抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，對(duì)肝細(xì)胞癌具有一定治療作用[6]，而且還能增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、改善臨床癥狀、緩解放化療帶來的不良反應(yīng)，提高患者生活質(zhì)量。

黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi），性寒，味苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，主治濕溫、暑濕，濕熱痞滿，瀉痢，黃疸，癰腫瘡毒，胎動(dòng)不安。研究發(fā)現(xiàn)，黃芩具有保肝、利膽、抗炎、抗菌、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)和心腦血管保護(hù)等多種藥理活性[7]，在榮震主任醫(yī)師治療HCC的學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)整理研究中[8]，無論是復(fù)方還是單味藥治療使用頻次最高的前10味中藥都包括黃芩。文獻(xiàn)報(bào)道，黃芩湯輔助序貫肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)對(duì)原發(fā)性肝癌患者的治療總有效率為67.86%，顯著高于不加黃芩湯對(duì)照組的48.21%，治療后患者的NF-κB、HIF-1α水平、AFP、腫瘤體積顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），抑制了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散[9]。然而關(guān)于黃芩治療HCC的臨床研究和相關(guān)分子機(jī)制卻少見報(bào)道。因此，從基因水平深入探討黃芩抗肝細(xì)胞癌的核心靶點(diǎn)及其相關(guān)分子機(jī)制，對(duì)HCC的防治具有重要意義，也為黃芩及其有效成分在防治肝癌方面的深入研究、開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）是一種系統(tǒng)生物學(xué)方法，通過引入加權(quán)的相關(guān)系數(shù)，構(gòu)建共表達(dá)的基因模塊，能從高通量數(shù)據(jù)中挖掘出模塊信息，描述不同樣品之間的基因關(guān)聯(lián)模式，根據(jù)模塊的內(nèi)聯(lián)性和模塊與表型之間的關(guān)聯(lián)性鑒定候補(bǔ)生物標(biāo)記物或治療標(biāo)靶。曾祎凡等[10]利用WGCNA技術(shù)挖掘促進(jìn)乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)DDX5和ACTB在循環(huán)腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，其中DDX5很可能是促進(jìn)乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因，在臨床上，DDX5可作為乳腺癌轉(zhuǎn)移早期鑒別的循環(huán)腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物，也能為改善乳腺癌預(yù)后提供新的治療靶點(diǎn)。由此可見，WGCNA技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因靶點(diǎn)或疾病生物標(biāo)志物的篩選之中，適用于中藥生物活性成分結(jié)合高通量數(shù)據(jù)聯(lián)合闡述疾病潛在的作用基因及多成分、多靶點(diǎn)、多通路的分子機(jī)制。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選黃芩的有效活性成分及基因靶點(diǎn)，通過WGCNA分析TCGA和GEO中的HCC相關(guān)數(shù)據(jù)，挖掘HCC的hub基因，并對(duì)這些基因進(jìn)行總生存期、無病生存期分析以及免疫組化驗(yàn)證，同時(shí)聯(lián)合GO生物學(xué)功能富集分析、KEGG信號(hào)通路富集分析進(jìn)一步探索黃芩抗HCC的相關(guān)分子機(jī)制，為后期開展黃芩防治HCC的實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 黃芩活性成分及其靶點(diǎn)的篩選與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)收納了在中國(guó)藥典中注冊(cè)的499種中草藥，包含29 384種成分，3311種靶標(biāo)和837種相關(guān)疾病，提供十二種與ADME（Absorption、Distribution、Metabolism、Excretion）相關(guān)的重要特性，如口服生物利用度、類藥性、半衰期、Caco-2滲透性、血腦屏障等，用于藥物篩選和評(píng)估[11]，其中口服生物利用度（OB）、腸上皮細(xì)胞通透性（Caco-2）和類藥性（DL）等被認(rèn)為是中草藥有效性的關(guān)鍵指標(biāo)[12]。本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索黃芩的全部活性成分及其作用靶點(diǎn)，以口服生物利用度（OB）≥40%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件[11]，得到黃芩主要的有效活性成分及其對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。再通過檢索UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）獲得去重復(fù)項(xiàng)后的靶點(diǎn)蛋白的基因symbol，將靶點(diǎn)上傳到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），設(shè)置“highest confidence（≥0.900）”，獲得靶點(diǎn)蛋白的相互作用信息及其相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，接著導(dǎo)入Cytoscape3.6.1，利用cytoHubba插件計(jì)算MCC（中心性），篩選連接程度排名前15的基因?yàn)辄S芩抗HCC候選基因靶點(diǎn)。

1.2 HCC數(shù)據(jù)下載

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載與HCC相關(guān)的424個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其中包括正常樣本50個(gè)，腫瘤樣本374個(gè)，相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：數(shù)據(jù)類別勾選轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、表達(dá)類別勾選基因表達(dá)量、Workflow類別勾選HTSeq-Counts、組織類別勾選肝和肝內(nèi)膽管、數(shù)據(jù)庫(kù)勾選TCGA，數(shù)據(jù)集勾選樣本量最多的一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（即TCGA-LIHC）。

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載與HCC相關(guān)的377個(gè)臨床數(shù)據(jù)，其中包括病人的生存時(shí)間、生存狀態(tài)、性別、年齡、肝癌分期等數(shù)據(jù)，相關(guān)參數(shù)設(shè)置為：數(shù)據(jù)類別勾選臨床數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)格式勾選bcr xml，組織類別、數(shù)據(jù)庫(kù)、數(shù)據(jù)集與下載轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時(shí)的參數(shù)一致。

從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE41804數(shù)據(jù)集的探針矩陣文件，該數(shù)據(jù)集含有20個(gè)HCC腫瘤樣品和20個(gè)非腫瘤樣品，通過基因芯片平臺(tái)GPL570 [HGU133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array下載數(shù)據(jù)集GSE41804的相關(guān)注釋信息文件。

1.3 HCC差異基因篩選

利用R語言（4.0.3版）對(duì)TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用edgeR數(shù)據(jù)包篩選差異表達(dá)基因，以log|FC|＞1、FDR＜0.05為篩選條件，通過limma數(shù)據(jù)包獲得差異基因（DEGs），再使用ggplot2、pheatmap數(shù)據(jù)包得到差異基因的聚類熱圖和火山圖，并輸出差異基因的RPKM值用于后續(xù)分析。

GEO數(shù)據(jù)同樣利用R語言（4.0.3版）進(jìn)行處理，通過使用limma、ggplot2、pheatmap數(shù)據(jù)包得到差異基因及其聚類熱圖和火山圖。

1.4 WGCNA分析

利用R語言（4.0.3版）的WGCNA包構(gòu)建HCC加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)基因和模塊、基因與臨床性狀進(jìn)行相關(guān)性分析。先通過樣本聚類樹算法過濾掉離群樣本，以保證共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的穩(wěn)定性，同時(shí)使共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的基因之間的連接服從無尺度網(wǎng)絡(luò)分布，然后利用Pick Soft Threshold函數(shù)選擇最合適的軟閾值β。隨后，將鄰接矩陣轉(zhuǎn)換為拓?fù)渲丿B矩陣（TOM）以降低虛假相關(guān)性和噪聲，計(jì)算出1-TOM作為共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)互連的重要生物學(xué)指標(biāo)和基因聚類的距離指標(biāo)，再采用動(dòng)態(tài)樹切割算法識(shí)別基因模塊，每個(gè)模塊至少包含50個(gè)基因。最后，計(jì)算基因模塊的特征值（ME），對(duì)模塊進(jìn)行層次化聚類，以0.25為剪切高度合并相似模塊，并用不同顏色加以標(biāo)記，根據(jù)模塊特征關(guān)系（ME與臨床特征之間成對(duì)的皮爾遜相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)＞0.80）確定具體的模塊。繪制出聚類模塊特征熱圖，并計(jì)算MM值（基因顯著性與模塊顯著性的相關(guān)系數(shù)）和GS值（基因與臨床特征的相關(guān)系數(shù)）。基因顯著性（GS）定義為基于臨床特征與基因表達(dá)之間的線性回歸P值（GS=logP）的log10變換，模塊顯著性（MS）是指模塊中所有基因的GS的平均值。

1.5 HCC交集基因篩選

一般認(rèn)為hub基因需要滿足以下條件：GS＞0.2，MM＞0.8，P≤0.05[13]。MS與GS的絕對(duì)值越大，說明與疾病越相關(guān)。根據(jù)WGCNA分析所獲得的聚類模塊特征熱圖，選擇與正常樣本、腫瘤樣本正相關(guān)性最高的兩個(gè)基因模塊進(jìn)行數(shù)據(jù)合并，對(duì)TCGA、GEO數(shù)據(jù)進(jìn)行相同處理后，利用R語言（4.0.3版）的VennDiagram數(shù)據(jù)包對(duì)上述合并后的兩個(gè)模塊基因與TCGA、GEO的差異基因取交集，輸出文本文件并繪制Venn圖，得到最終的HCC相關(guān)基因，并將得到的交集基因與黃芩的15個(gè)候選基因靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，獲得黃芩抗HCC的潛在基因靶點(diǎn)。

1.6 GO與KEGG富集分析

利用R語言（4.0.3版）的org.Hs.eg.db數(shù)據(jù)包對(duì)上述交集基因進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后獲得相應(yīng)的entrezID，再利用 R 語言（4.0.3版）的 clusterProfiler、enrichplot、ggplot2等數(shù)據(jù)包對(duì)交集基因進(jìn)行GO、KEGG富集分析。

1.7 hub基因識(shí)別

將WGCNA構(gòu)建的hub基因模塊中的全部基因取交集后，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，基因間相關(guān)性打分設(shè)置為0.900，從而獲得交集基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系文件，通過Cytoscape3.6.1對(duì)網(wǎng)絡(luò)文件進(jìn)行可視化分析，下載插件CytoHubba計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的最大團(tuán)中心性分?jǐn)?shù)（MCC值）并排序，將得分排名前10的基因作為hub基因，并將hub基因與黃芩抗HCC的潛在基因靶點(diǎn)整合，用于下一步分析。

1.8 OS與DFS分析

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)hub基因進(jìn)行OS、DFS分析，根據(jù)HCC患者h(yuǎn)ub基因表達(dá)量的中位數(shù)進(jìn)行分組，將HCC患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，置信區(qū)間設(shè)置為95%并計(jì)算P值，癌癥類型選擇LIHC（肝細(xì)胞癌），繪制生存曲線用于可視化分析，篩選與HCC相關(guān)的核心基因。

1.9 免疫組化驗(yàn)證

進(jìn)入HPA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.proteinatlas.org/），分別在搜索攔中輸入上述篩選到的核心基因名點(diǎn)擊搜索，選擇“pathology”進(jìn)入病理界面，看該基因在腫瘤樣品中的免疫組化圖譜，找到“protein expression”,找到肝癌，點(diǎn)擊進(jìn)入肝癌頁(yè)面，向下拉可以找到免疫組化的圖片?？贵wHPA代碼必須與正常樣品保持一致。如若要看基因在正常樣品中的免疫組化圖片，可以在搜索欄輸入基因名后，點(diǎn)擊“Tissue”進(jìn)入組織頁(yè)面，余下操作同腫瘤樣品。收集免疫組化圖譜信息，根據(jù)蛋白質(zhì)在組織細(xì)胞中的染色程度以及染色細(xì)胞百分比，比較正常組織和HCC組織中蛋白表達(dá)的差異，并下載保存相應(yīng)的免疫組化圖片。

2 結(jié)果

2.1 黃芩活性成分及靶點(diǎn)與PPI網(wǎng)絡(luò)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到黃芩化學(xué)成分143種，以O(shè)B≥40%、DL≥0.18為篩選條件，得到19種主要活性成分，分別為黃芩新素、欖核蓮黃酮、甲氧基黃酮、黃芩黃酮II、甲氧基查爾酮、二氫木蝴蝶素、苯基苯并吡喃酮、鼠尾草素、表兒茶素、二甲氧基黃酮、蘇薺苧黃酮、豆甾醇、二羧酸苯酯、鄰苯二甲酸二異辛酯、表小檗堿、千層紙素、黃烷酮、紅花素、二氫黃芩苷，見表1，其中黃芩新素的OB值、DL值最高，可能是黃芩抗HCC最主要的生物活性成分。

表1 黃芩主要活性成分及其OB、DL值表

19種主要活性成分的靶點(diǎn)去重復(fù)項(xiàng)后，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖1。將靶點(diǎn)蛋白的相互作用信息文件導(dǎo)入Cytoscape3.6.1，利用cytoHubba插件提取中心子網(wǎng)絡(luò)，以MCC進(jìn)行排序獲得的前15個(gè)候選基因靶點(diǎn)依次為 NCOA1、NCOA2、ESR1、AR、RXRA、PPARG、PGR、ESR2、MAPK14、ADRA1B、ADRB2、CYP2C9、PTGS2、ADRA1A、CHRM3，見圖2。

2.2 HCC差異基因

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載與HCC相關(guān)的424個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)樣本，共包括13913個(gè)基因，篩選后獲得2703個(gè)差異基因，其中下調(diào)基因1680個(gè)（左側(cè)），上調(diào)基因1023個(gè)（右側(cè)），火山圖見圖3A。

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載的與HCC相關(guān)的20個(gè)腫瘤樣品和20個(gè)非腫瘤樣品，共包括21 655個(gè)基因，篩選后獲得1050個(gè)差異基因，其中下調(diào)基因621個(gè)（左側(cè)），上調(diào)基因429個(gè)（右側(cè)），火山圖見圖3B。

圖1 黃芩主要活性成分靶點(diǎn)的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 以MCC進(jìn)行排序獲得的前15個(gè)候選基因靶點(diǎn)圖（黃芩）

圖3 HCC差異基因火山圖

2.3 WGCNA分析

本研究中，TCGA數(shù)據(jù)選擇軟閾值β=3（無尺度R2=0.9），動(dòng)態(tài)樹切割共識(shí)別出9個(gè)基因模塊，見圖4A；GEO數(shù)據(jù)則選擇軟閾值β=2（無尺度R2=0.9），動(dòng)態(tài)樹切割共識(shí)別出11個(gè)基因模塊，見圖4B?；蚰K與臨床性狀之間的相關(guān)性如下圖所示，可知TCGA數(shù)據(jù)中與正常樣本、腫瘤樣本正相關(guān)性最高的模塊分別是黃綠色模塊（MEgreenyellow，R=0.64，P=2e-50）、藍(lán)色模塊（MEblue，R=0.69，P=8e-62），見圖4C；GEO數(shù)據(jù)中與正常樣本、腫瘤樣本正相關(guān)性最高的模塊分別是藍(lán)色模塊（MEblue，R=0.44，P=0.005）、青綠色模塊（MEturquoise，R=0.75，P=2e-08），見圖4D。因此，我們選擇這四個(gè)模塊中的差異基因進(jìn)行下一步分析。

2.4 HCC交集基因

如圖5所示，TCGA數(shù)據(jù)中黃綠色模塊和藍(lán)色模塊合并后共4701個(gè)基因，GEO數(shù)據(jù)中藍(lán)色模塊和青綠色模塊合并后共5928個(gè)基因，這些基因與TCGA數(shù)據(jù)中的2703個(gè)差異基因、GEO數(shù)據(jù)中的1050個(gè)差異基因取交集，共得到115個(gè)基因，而后將這115個(gè)交集基因與黃芩的15個(gè)候選基因靶點(diǎn)進(jìn)行一一比對(duì)，獲得黃芩抗HCC的潛在基因靶點(diǎn)ADRA1A。

圖4 WGCNA聚類樹狀圖及聚類模塊特征熱圖

圖5 交集基因與差異基因Venn圖

2.5 GO與KEGG富集分析

圖6 基因富集分析圖

GO分析結(jié)果如圖6A所示，上述115個(gè)交集基因富集在體液免疫反應(yīng)、細(xì)胞粘附、補(bǔ)體激活、呼吸系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞過渡金屬離子穩(wěn)態(tài)、BMP信號(hào)通路的調(diào)節(jié)、反射等生物學(xué)過程（BP）；KEGG分析結(jié)果如圖6B所示，上述115個(gè)交集基因富集在膽固醇代謝、礦物質(zhì)吸收、基底細(xì)胞癌、泛醌和其他萜類醌的生物合成、視黃醇代謝、細(xì)胞粘附、吞噬體等通路。如圖7所示，交集基因在HCC中主要涉及Wnt信號(hào)通路，即Wnt與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活第二信使Dvl，從而抑制由GSK-3β、Axin、APC組成的三元復(fù)合物的活性，使β-catenin不能被GSK-3β正常磷酸化，造成β-catenin在胞漿內(nèi)大量積聚并移向細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而與細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活TCF轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。

2.6 hub基因識(shí)別

通過Cytoscape3.6.1的cytoHubba插件提取上述115個(gè)交集基因的中心子網(wǎng)絡(luò)，使用CytoHubba插件中的MCC算法計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的最大團(tuán)中心性分?jǐn)?shù)（MCC值），按MCC值的大小進(jìn)行排序，MCC得分排名前10的關(guān)鍵基因依次為FCN2、COLEC11、CFP、COLEC10、FCN3、C7、LCN2、HAMP、B3GAT1、LYVE1。將這10個(gè)基因與黃芩抗HCC的潛在基因靶點(diǎn)ADRA1A整合，用于下一步分析。

2.7 OS與DFS分析

根據(jù)總生存期曲線和無病生存期曲線，觀察整合后的11個(gè)基因在總生存期與無病生存期的基因表達(dá)差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），從而進(jìn)一步篩選出與HCC密切相關(guān)的核心基因。OS分析結(jié)果顯示，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因有FCN3（P=0.033）、ADRA1A（P=0.012）、C7（P=0.03）、COLEC10（P=0.015），且這些基因高表達(dá)的患者前80個(gè)月生存率更高；DFS分析結(jié)果顯示，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因有CFP（P=0.029）、FCN3（P=0.0086），且這些基因高表達(dá)的患者同樣生存率更高，見圖8。因此，這5個(gè)基因可能是黃芩治療HCC的核心基因，分別為纖維膠凝蛋白3（FCN3）、腎上腺素能α1A受體（ADRA1A）、補(bǔ)體C7（C7）、凝集蛋白家族 10（COLEC10）、補(bǔ)體因子備解素（CFP）。其中，纖維膠凝蛋白3在OS、DFS分析中均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是與HCC關(guān)系最密切的基因。

圖7 交集基因生成的HCC相關(guān)信號(hào)通路

圖8 HCC的5個(gè)密切相關(guān)基因OS、DFS分析

圖9 肝正常組織與HCC組織的免疫組化圖

2.8 免疫組化驗(yàn)證

通過HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分別檢索COLEC10、CFP、ADRA1A，免疫組化結(jié)果為空；FCN3、C7免疫組化結(jié)果如圖9所示，抗體CAB025945在正常肝組織中FCN3呈現(xiàn)中等強(qiáng)度染色，在HCC組織中則呈現(xiàn)低強(qiáng)度染色，染色細(xì)胞百分比為25%-75%；抗體HPA001465在正常肝組織中C7呈現(xiàn)高強(qiáng)度染色，在HCC組織中則呈現(xiàn)中等強(qiáng)度染色，染色細(xì)胞百分比均超過75%。這表明與正常肝組織相比，HCC組織中FCN3、C7基因表達(dá)量降低，該結(jié)果與OS、DFS分析所得結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)黃芩可能是通過黃芩新素、欖核蓮黃酮、二氫黃芩苷等活性成分，降低ADRA1A甲基化頻率從而干預(yù)HCC的發(fā)生；通過對(duì)TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因篩選、WGCNA分析、GO與KEGG富集分析，并經(jīng)過OS、DFS、HPA 分析驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn) FCN3、C7、COLEC10、CFP可能是HCC的核心基因，其作用機(jī)制可能涉及體液免疫、補(bǔ)體激活、吞噬作用調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡等過程。

黃芩化學(xué)成分眾多，目前為止已被發(fā)現(xiàn)的約有40多種，包括黃酮類化合物、萜類、氨基酸、甾醇、揮發(fā)油和其他成分，其中黃酮類化合物是黃芩主要的有效成分和特征性成分。研究表明，黃酮類化合物中發(fā)揮抗肝癌作用的主要是黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素和漢黃芩苷4種活性物質(zhì)。杜忠良等[14]發(fā)現(xiàn)黃芩素能抑制肝癌移植瘤的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與調(diào)控PI3K-AKT通路有關(guān)。魯興梅等[15]認(rèn)為黃芩苷可抑制肝癌荷瘤小鼠瘤組織的增長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)瘤組織PI3K、AKT和m TOR基因及蛋白表達(dá)有關(guān)。王曉東[16]證明漢黃芩素能通過線粒體信號(hào)通路促進(jìn)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的凋亡、抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖。本研究綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、癌癥基因組圖譜和基因芯片技術(shù)，得到黃芩新素、欖核蓮黃酮、二氫木蝴蝶素、二氫黃芩苷等19種黃芩主要活性成分，其中黃芩新素的口服利用度高達(dá)104.34%，類藥性也達(dá)到了0.44，具有很高的研究?jī)r(jià)值。而且目前國(guó)內(nèi)外對(duì)黃芩有效活性成分的研究多集中在黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等含量較高的黃酮類成分，對(duì)于黃芩新素的研究非常少，而且多集中在提取及制備工藝方面。近年來研究發(fā)現(xiàn)，黃芩新素是誘導(dǎo)白血病細(xì)胞HL-60和K562凋亡的主要活性成分，其通過上調(diào)PP2A表達(dá)，下調(diào)miR-21表達(dá)，使PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路失活，從而降低肺癌發(fā)生率[17]。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)，雖然黃芩新素在黃芩中的含量較低，但它能特異性結(jié)合在免疫抑制和腫瘤生長(zhǎng)中起重要作用的靶蛋白STAT3。因此，我們猜測(cè)黃芩新素是否也能作為一個(gè)重要的活性物質(zhì)發(fā)揮抗肝癌作用呢？這也將為黃芩有效成分及藥理作用的進(jìn)一步挖掘和HCC的防治提供一個(gè)新思路。

GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，黃芩主要涉及與肝癌相關(guān)的信號(hào)通路是Wnt信號(hào)通路，這與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致，Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與肝臟疾病進(jìn)展的所有階段，該信號(hào)通路的異常將導(dǎo)致肝細(xì)胞癌、肝母細(xì)胞瘤和膽管癌等多種肝癌的發(fā)生，Wnt/β-catenin信號(hào)通路受到多種因子的調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中β-catenin不能正常降解時(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化增強(qiáng)，多種腫瘤疾病由此引發(fā)。目前已經(jīng)有多項(xiàng)研究報(bào)道了調(diào)控該信號(hào)通路可以抑制肝癌的潛在價(jià)值[20-21]，因此我們有理由相信黃芩的活性物質(zhì)黃芩新素可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路上下游相關(guān)基因的表達(dá)，作為防治肝細(xì)胞癌潛在藥物的出現(xiàn)是極有可能的。

本研究發(fā)現(xiàn)黃芩抗HCC的潛在基因靶點(diǎn)ADRA1A，篩選出的HCC核心基因?yàn)镕CN3、C7、COLEC10、CFP。腎上腺素能α1A受體（ADRA1A）是一類通過結(jié)合兒茶酚胺刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)（SNS）的G蛋白偶聯(lián)受體，Chen等[22]的研究表明，與癌旁組織相比，在HCC組織中，ADRA1A mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低，其啟動(dòng)子區(qū)的平均甲基化水平顯著增加（17.0% vs.25.2%，P＜0.0001），ADRA1A基因高甲基化可能導(dǎo)致HCC的發(fā)生，這與本研究中ADRA1A的OS分析結(jié)果一致（ADRA1A高表達(dá)的患者前80個(gè)月生存率更高），因此，ADRA1A是黃芩治療HCC的有前景的基因靶點(diǎn)。纖維膠凝蛋白3（FCN3）是機(jī)體天然免疫的關(guān)鍵性分子，主要參與補(bǔ)體激活、吞噬作用調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡過程[23]，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CN3功能障礙或表達(dá)異常可能造成人類某些感染性疾病、慢性疾病及自身免疫性疾病的發(fā)生[24]，與KEGG富集分析結(jié)果一致。補(bǔ)體C7是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，通過補(bǔ)體經(jīng)典途徑或者凝集素途徑激活，補(bǔ)體途徑還可激活天然免疫系統(tǒng)，在抵抗細(xì)菌等病原體感染中起重要作用。張?chǎng)蔚萚25]報(bào)道，通過供肝組織SNP檢測(cè)分型發(fā)現(xiàn)，供肝C7 rs6876739基因型與肝移植術(shù)后的早期細(xì)菌感染顯著相關(guān)，這可能與移植肝中C7合成減少有關(guān)；Würzner等[26]報(bào)道，移植肝合成高達(dá)50%以上的C7，說明C7可作為HCC的預(yù)后因子。凝集蛋白家族10（COLEC10）是HCC中miR-452-5p的直接靶標(biāo)，miR-452-5p過表達(dá)能夠顯著加速細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期從G1轉(zhuǎn)變，抑制癌細(xì)胞的凋亡[27-28]，說明COLEC10是HCC的核心基因之一。OS與DFS分析、以及免疫組化驗(yàn)證也已證實(shí)，F(xiàn)CN3、C7、COLEC10、CFP的異常表達(dá)與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，本研究初步揭示了黃芩抗HCC的潛在基因靶點(diǎn)和HCC核心基因，探討了其相關(guān)分子機(jī)制，為后期開展黃芩治療HCC的實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供理論參考。但本研究仍然存在不足和局限性：

（1）數(shù)據(jù)來源比較單一

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的重要基礎(chǔ)是對(duì)不同來源數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，不同數(shù)據(jù)庫(kù)如常用的中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)（ETCM、TCMSP、TCMID、TCM）數(shù)據(jù)收錄差異大、且數(shù)據(jù)信息之間無有效關(guān)聯(lián)相對(duì)比較獨(dú)立，因此數(shù)據(jù)收集的完整性和整合分析對(duì)研究結(jié)果的可靠性、可重現(xiàn)性有較大影響。本研究黃芩活性成分及其靶點(diǎn)的篩選選用的是TCMSP，來源比較單一，一定程度上可能影響研究結(jié)果的重復(fù)性。以后我們可以盡量通過整合多個(gè)來源的數(shù)據(jù)、同時(shí)結(jié)合臨床或?qū)嶒?yàn)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、檢測(cè)和補(bǔ)充[29]。

（2）缺乏更加有效、科學(xué)的驗(yàn)證

本研究遵守2021年世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)發(fā)布的《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》[30-31]，并按要求對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行可靠性評(píng)價(jià)、規(guī)范性評(píng)價(jià)和合理性評(píng)價(jià)。但在結(jié)果驗(yàn)證方面，本研究目前還停留在文獻(xiàn)驗(yàn)證和計(jì)算機(jī)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證階段，缺乏更加科學(xué)有效和更具說服力的驗(yàn)證方式，如體外細(xì)胞模型、動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，甚至臨床試驗(yàn)驗(yàn)證等方式。