病證結(jié)合便秘動(dòng)物模型研究進(jìn)展

朱書斌 劉金響 張聰偉 馮群虎

(1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽，712046； 2 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，咸陽，712000； 3 深圳市保安中醫(yī)醫(yī)院，深圳，518100)

便秘是指排便困難，每周大便次數(shù)少于3次，伴或者不伴大便干硬的疾病[1]，具有頑固性、復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)，可發(fā)生于任何年齡段?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)中尚無特效藥物能徹底治愈便秘，僅能對(duì)癥治療取得短期療效，常用的藥物有乳果糖、聚乙二醇電解質(zhì)散、開塞露等，但導(dǎo)瀉藥多具有依賴性，停藥后易反復(fù)，長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，威脅患者的身體健康[2]。而中醫(yī)藥通過辨證論治，可以取得較好的療效，同時(shí)減少患者的不良反應(yīng)及復(fù)發(fā)率[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，近10年中醫(yī)治療便秘機(jī)制的研究中，中醫(yī)證候便秘造模多選用西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的便秘動(dòng)物模型[4-5]。中醫(yī)辨證論治體現(xiàn)在不同的中藥方劑治療不同的證型[1]，因此在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)特定證型的動(dòng)物模型至關(guān)重要。但中醫(yī)證型抽象，相關(guān)的研究經(jīng)驗(yàn)比較缺乏，目前的研究均采用“病證結(jié)合”的方式復(fù)制相關(guān)證型的模型[4]，在便秘的動(dòng)物模型中，此種方法亦被廣泛使用。雖然有相關(guān)的綜述闡述了便秘不同證型動(dòng)物模型復(fù)制方法[5-6]，但仍比較籠統(tǒng)，對(duì)用藥劑量、造模時(shí)間、造模流程等敘述不清，對(duì)模型復(fù)制的指導(dǎo)意義不大。為了深入了解中醫(yī)證型便秘模型復(fù)制過程中的細(xì)節(jié)問題，現(xiàn)從藥物劑量、造模周期、模型評(píng)價(jià)方式等細(xì)節(jié)方面進(jìn)行歸納綜述，為以后的研究提供參考。

1 便秘動(dòng)物模型分類

根據(jù)《便秘中醫(yī)診療專家共識(shí)意見(2017)》，臨床分為“熱積秘”“寒積秘”“氣滯秘”“氣虛秘”“陽虛秘”“陰虛秘”6種證型[1]。通過文獻(xiàn)整理發(fā)現(xiàn)中醫(yī)證型便秘模型與臨床分型不完全相同，常見的動(dòng)物模型包含“脾虛型便秘”“血虛型便秘”“陽虛型便秘”“津虧型便秘”4種，以虛證便秘居多。

2 便秘模型復(fù)制方法

2.1 脾虛型便秘 脾虛型便秘多選用昆明小鼠，模型復(fù)制方法為“番瀉葉灌胃+控制飲食、饑飽失常法”[7-9]。先用濃度為100%的純番瀉葉溶液灌胃，制造脾虛證模型；待脾虛模型制備成功后，再用控制飲食，給予模型動(dòng)物間斷性喂食的方法制備便秘模型。脾虛型便秘模型具體復(fù)制方法如下：第1步，先將所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2～7 d，然后利用100%濃度的純番瀉葉溶液0.4～0.8 mL給小鼠灌胃，每日灌胃2次，連續(xù)灌胃7 d，番瀉葉灌胃期間，所有小鼠自由飲食；第2步，從第8天開始，停止番瀉葉灌胃，并禁飲食，每隔1 d給每只小鼠4～8 g低纖維飼料生大米，并讓所有小鼠自由飲水0.5 h，之后繼續(xù)禁飲食，共持續(xù)8 d。脾虛便秘的造模共持續(xù)15 d，造模結(jié)束后評(píng)價(jià)小鼠造模是否成功。

若小鼠體型干癟、瘦小、體毛無光澤、拱背、精神萎靡，活動(dòng)減少，體質(zhì)量減輕，大便干燥結(jié)塊、排便減少、大便顆粒細(xì)?。荒c道組織特征：將模型動(dòng)物頸脫臼處死后解剖，若大便集結(jié)在結(jié)腸，且大便性狀為球狀或串珠狀，空腸、回腸無明顯糞便殘留；腸道推進(jìn)率和血清D-木糖水平降低，則表示脾虛便秘模型復(fù)制成功。腸道推進(jìn)率評(píng)估方法：在造模結(jié)束后，給予活性炭或者墨汁灌胃，觀察模型動(dòng)物與正常動(dòng)物第1粒黑便排出時(shí)間，若大于正常動(dòng)物的排出時(shí)間，則表示腸道推進(jìn)率降低。

100%濃度的純番瀉葉溶液制備方法參照彭昕欣等[10]的研究：第1步，取500 g番瀉葉，并加入10倍量的沸水，即5 000 g沸水，浸泡10 min；第2步，將番瀉葉過濾，取得的濾液放入75 ℃的水浴鍋中蒸發(fā)濃縮，當(dāng)生藥濃度達(dá)到1 g/mL時(shí)，100%濃度的純番瀉葉溶液制備成功。制備成功的純番瀉葉溶液需要放置在4 ℃的條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 血虛型便秘 血虛便秘模型多選用昆明小鼠(KM小鼠)，采用“腹腔注射藥物+灌胃”的方法制備，模型復(fù)制周期共28 d[11-12]。具體復(fù)制步驟如下：第1步，先將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2～7 d，在自由飲食的情況下，在第1、4、7、10天的時(shí)候，按照小鼠體質(zhì)量60 μg/g的劑量給予乙酰苯肼皮下注射，1次/d；第2步，在第10～14天時(shí)，按照小鼠體質(zhì)量40 μg/g的劑量給予環(huán)磷酰胺腹腔注射，1次/d，用以復(fù)制血虛模型；同時(shí)在第10～14天時(shí)，按照小鼠體質(zhì)量25 μg/g的劑量給予復(fù)方地芬諾酯混懸液灌胃，1次/d，復(fù)制便秘模型；第3步，將第1步和第2步的操作重復(fù)1次，復(fù)制血虛便秘小鼠模型。此外，在劉五州等[13]的研究中，報(bào)告了另一種血虛便秘造模方法：模型復(fù)制共需要4周，所有動(dòng)物正常喂養(yǎng)。第1步，在老鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，將鼠尾尖部消毒后，剪去尾尖端2 mm，并將尾尖浸入38 ℃恒溫水浴中放血3 min，之后再正常喂養(yǎng)2周；第2步，從第3周開始，每次用20 μL毛細(xì)吸管，在眼眶靜脈竇放血約0.6 mL，每周1次，制備血虛模型；同時(shí)從第3周開始，采用鹽酸洛哌丁胺灌胃，按照小鼠體質(zhì)量3.0 mg/kg的劑量換算，1次/d，持續(xù)2周，以復(fù)制便秘模型。若模型動(dòng)物出現(xiàn)精神萎靡、蜷縮、運(yùn)動(dòng)量減少，毛枯疏、無光澤，耳、鼻、唇、尾蒼白，排便次數(shù)減少，糞便質(zhì)地干結(jié)、粘連，腸道推進(jìn)率降低，同時(shí)血液中紅細(xì)胞及血紅蛋白水平下降，則表示血虛便秘模型復(fù)制成功。

2.3 陽虛型便秘 陽虛型便秘模型復(fù)制方法有2種。第1種以“食醋+冰水活性炭灌胃”復(fù)制陽虛秘模型[14]：現(xiàn)有的陽虛秘模型研究以大鼠為主，造模周期共9 d，適應(yīng)性喂養(yǎng)2～7 d。造模的第1天按照大鼠體質(zhì)量20 mL/kg的劑量，給予白醋灌胃，之后以15 mL/kg的劑量灌胃，1次/d；并在第7天開始，加用0 ℃的活性炭冰水灌胃，2次/d，持續(xù)3 d，模型復(fù)制完成。第2種以“咯哌丁胺懸液灌胃+給予氫化可的松肌內(nèi)注射”的方法進(jìn)行模型復(fù)制[15]：造模周期共21 d，選用200 g左右的Wistar大鼠，造模周期共21 d。先按照大鼠體質(zhì)量3.0 mg/kg給予咯哌丁胺懸液灌胃，同時(shí)按照25 mg/kg的劑量給予氫化可的松后肢肌內(nèi)注射，1次/d。造模完成后，給予大鼠活性炭灌胃1次，記錄大鼠排出首粒黑便的時(shí)間。若模型動(dòng)物出現(xiàn)畏寒喜暖、踡縮、運(yùn)動(dòng)量減少，倦怠嗜睡、消瘦，大便質(zhì)地干或不干，排出困難，且腸道推進(jìn)率降低，表明陽虛便秘模型復(fù)制成功。

2.4 津虧型便秘 津虧型便秘目前尚無成熟的動(dòng)物模型，現(xiàn)有的研究多采用“限水+藥物注射或灌胃”的方法復(fù)制便秘模型，共有2種。第1種采用“限水+洛哌丁胺灌胃法”進(jìn)行模型復(fù)制[16]，多采用無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級(jí)SD[美國(guó)斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley)農(nóng)場(chǎng)用Wistar大鼠培育而成]大鼠，造模周期共5周。但現(xiàn)有文獻(xiàn)中對(duì)給藥的次數(shù)、持續(xù)時(shí)間、具體飲水劑量均未明確描述，具體操作中仍需審慎參考。每只大鼠每日正常進(jìn)食，給予每日平均正常飲水量的1/3，為嚴(yán)格控制單只大鼠飲水量，具體飲水量需要根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)獲得更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)，并按照大鼠體質(zhì)量1.5 mg/kg的劑量給予洛哌丁胺溶液灌胃，按照125 mg/kg的劑量給予D-半乳糖皮下注射。第2種采用“限水+復(fù)方地芬諾酯混懸液灌胃”[17]，選取200 g左右的SD大鼠，造模周期為7 d，每只大鼠每日正常進(jìn)食，給予每日平均正常飲水量的1/3，約10 mL；同時(shí)按照大鼠體質(zhì)量10 mg/kg的劑量，將復(fù)方地芬諾酯溶入2 mL的生理鹽水中，制成混懸液，另行灌胃。每只大鼠每日灌胃4次，第1次先用復(fù)方地芬諾酯混懸液灌胃，之后將10 mL雙純水分3次進(jìn)行灌胃，每次間隔時(shí)間相等。若實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)糞便干硬，呈黃豆樣大小，精神倦怠、皮毛光澤變暗、小便量少色黃，排便次數(shù)、排便量顯著減少，同時(shí)，腸道推進(jìn)率降低，解剖見糞粒積結(jié)在結(jié)腸，呈圓珠狀或串珠狀，空腸、回腸內(nèi)容物較少，則津虧便秘模型復(fù)制成功。

3 討論

3.1 便秘動(dòng)物模型的中醫(yī)理論基礎(chǔ) 中醫(yī)理論認(rèn)為虛證便秘的病因與患者的體質(zhì)、飲食習(xí)慣、年齡等有關(guān)[1]。若患者飲食勞倦，損傷脾胃或過食生冷、苦寒攻伐，傷及氣陽，中焦脾胃受損，則水谷運(yùn)化無力，氣虛則大腸傳導(dǎo)無力，陽虛則腸道失于溫煦，致使陰寒內(nèi)結(jié)，排便時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致便秘；年老患者，素體陰虛，或失血奪汗，傷津亡血，導(dǎo)致陰虧血少，血虛則大腸不榮，陰虧則大腸干澀，腸道失潤(rùn)，大便干結(jié)，便下困難，而成便秘。

在脾虛便秘中，利用“番瀉葉灌胃+控制飲食、饑飽失常法”復(fù)制動(dòng)物模型[9,18]，番瀉葉苦寒攻下，藥效峻猛，損傷氣陽；控制飲食、饑飽失常則損傷脾胃，模型具備一定的合理性，但番瀉葉屬于攻下藥，常用于脾虛泄瀉動(dòng)物模型的復(fù)制[19-20]，用于便秘模型仍有一定爭(zhēng)議；在陽虛便秘模型中，運(yùn)用“0 ℃冰水灌胃”復(fù)制陽虛模型，遵循中醫(yī)“苦寒傷陽”的理論，但冰水灌胃首先傷及脾胃，所復(fù)制模型應(yīng)為脾陽虛模型；“注射氫化可的松”復(fù)制的陽虛模型應(yīng)為腎陽虛模型[21]，基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論的研究認(rèn)為腎陽虛的病理機(jī)制與下丘腦-垂體-靶腺軸功能紊亂有關(guān)，而氫化可的松可導(dǎo)致使下丘腦-垂體-腎上腺功能減退，抑制促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放，模擬中醫(yī)理論的腎陽虛證[22]。在血虛證模型中[11]，乙酰苯肼是一種強(qiáng)氧化劑，可以誘導(dǎo)溶血，導(dǎo)致紅細(xì)胞和血紅蛋白減少；環(huán)磷酰胺是一種細(xì)胞毒性化療藥物，會(huì)產(chǎn)生骨髓抑制作用，導(dǎo)致骨髓造血系統(tǒng)異常，2種藥物聯(lián)合，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生貧血，模擬中醫(yī)理論的血虛證，但有會(huì)議論文報(bào)道環(huán)磷酰胺還用于腎陽虛模型的制備[23-25]，理論基礎(chǔ)仍不十分明確；“剪尾法”使得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物失血，模擬“亡血”病因?qū)е碌难撟C。在津虧模型的復(fù)制中，限制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲水可以模擬傷津的病因，但限水方法描述不夠完善，缺少每日飲水量，需要前期實(shí)驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)，為控制實(shí)驗(yàn)變量，保證造模成功率，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)單籠飼養(yǎng)，但目前的文獻(xiàn)未明確報(bào)告飼養(yǎng)方法。

3.2 中醫(yī)證型動(dòng)物模型的局限性 中醫(yī)理論中的“證”概念較抽象，不同于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的疾病概念，一個(gè)完整的證型診斷必須包括舌苔和脈象，但是在動(dòng)物模型中目前尚無法做到對(duì)舌苔、脈象的復(fù)制和觀察，缺少了中醫(yī)證型辨證的一個(gè)重要體征[26]。在目前的研究中，中醫(yī)證型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多采用“病證結(jié)合”的方式，利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段，分別復(fù)制西醫(yī)疾病模型和中醫(yī)證型模型，二者疊加構(gòu)成中醫(yī)證型的動(dòng)物模型，這種模型復(fù)制方式，割裂了中醫(yī)理論中病和證的關(guān)系，不合乎中醫(yī)臨床病證的理念[4]。在模型復(fù)制過程中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所用的藥物種類較多，如番瀉葉、環(huán)磷酰胺、乙酰苯肼、氫化可的松、地芬諾酯、洛哌丁胺，其中不少藥物復(fù)制的動(dòng)物模型仍存在一定爭(zhēng)議，如環(huán)磷酰胺劑可以導(dǎo)致血虛[11,27-28]，也可以導(dǎo)致陽虛[23-25]；番瀉葉常用于脾虛泄瀉模型[19]，是否可以用于便秘模型；還有人認(rèn)為冰水灌胃屬于冷秘模型[29]。還有藥物使用劑量的問題，在同一證型的模型中，存在不同的使用劑量，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。

除以上問題，便秘動(dòng)物模型尚缺乏科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑u(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有的研究評(píng)估手段單一，針對(duì)便秘的評(píng)估以糞便質(zhì)地、數(shù)量、第1粒黑便排出時(shí)間、腸道推進(jìn)率等為主；針對(duì)中醫(yī)證型的評(píng)估指標(biāo)僅以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的癥狀為主，但卻存在癥狀相似的問題，如血虛、腎虛、脾虛模型均有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物消瘦、倦怠、蜷縮的癥狀，證型鑒別存在一定困難，模型復(fù)制成功的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)仍需進(jìn)一步研究完善。

3.3 中醫(yī)證型動(dòng)物模型改進(jìn)方法 首先，改進(jìn)病證結(jié)合法模擬的中醫(yī)證型，在模型復(fù)制階段，不應(yīng)機(jī)械地將中醫(yī)證型模型和便秘模型疊加，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及所要驗(yàn)證的中藥治療理論機(jī)制，結(jié)合中醫(yī)病因病機(jī)，從飲食、情志、生活習(xí)性等方面復(fù)制中醫(yī)證型模型，更符合臨床實(shí)際情況。如針對(duì)陰虛模型，采用年老的大鼠[30]；熱秘模型采用高脂高熱量喂養(yǎng)，模擬飲食習(xí)慣所致的便秘；其次，完善模型評(píng)價(jià)體系，對(duì)中醫(yī)證型及便秘模型分開評(píng)價(jià)，在便秘模型評(píng)價(jià)指標(biāo)中，存在相似癥狀及體征，無法做到“四診合參”，容易干擾判斷。應(yīng)參考現(xiàn)有的研究，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的檢測(cè)手段，適當(dāng)納入血液指標(biāo)的檢測(cè)，并充分觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的表現(xiàn)，揚(yáng)長(zhǎng)避短，如血虛模型檢測(cè)紅細(xì)胞及血紅蛋白水平[13]，津虧模型檢測(cè)腸道含水量等[31-32]。便秘模型的評(píng)價(jià)可以通過觀察大便性狀、含水量，并結(jié)合腸道推進(jìn)率評(píng)估，將評(píng)估指標(biāo)統(tǒng)一；在便秘造模用藥中，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求選取不同的藥物，探索造模用藥的最佳劑量，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，將實(shí)驗(yàn)規(guī)范化、合理化。

4 小結(jié)

雖然中醫(yī)證型動(dòng)物模型仍不完善，不能完全符合中醫(yī)臨床證型，現(xiàn)有研究的種類也未完全囊括臨床證型，需要不斷地補(bǔ)充。但可通過不斷改進(jìn)和完善，為中醫(yī)藥的基礎(chǔ)機(jī)制研究發(fā)揮重要作用。