丁萍 *，蔡燕斌 ，顧強，金凱

1.張家港檢驗認證有限公司（張家港 215600）；2.張家港海關(guān)綜合技術(shù)中心（張家港 215600）；3.江蘇君信新華安全科技有限公司（張家港 215600）

根據(jù)心理學(xué)家的分析結(jié)果，人們憑感覺接受的外界信息中，83%的印象來自視覺，可見產(chǎn)品外觀的重要性。合成著色劑因其具有著色力強、色澤鮮艷、不易褪色、易溶解、易調(diào)色、價格低廉等特點，被廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)。然而，一些合成著色劑具有潛在的毒性和致癌性[1]，因此世界各國對合成著色劑的使用范圍和限量都有嚴格的規(guī)定[2]。GB 2760—2014[3]《食品安全國家標(biāo)準 食品添加劑使用標(biāo)準》亦對合成著色劑的使用范圍和限量進行了嚴格的規(guī)定。

目前，食品中合成著色劑的測定方法主要有薄層色譜法[4]、極譜法[5]、高效液相色譜法[6-10]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[11]等。其中高效液相色譜法得到廣泛的應(yīng)用，該方法中前處理方法主要有透析法[7]、固相萃取（solid phase extraction，SPE）法[12-13]、聚酰胺粉吸附法[14-16]等。其中SPE法和聚酰胺粉吸附法是當(dāng)前測定合成著色劑最為普遍采用的前處理方法。然而，這兩種方法操作都相對繁瑣，其中聚酰胺粉吸附法經(jīng)常出現(xiàn)難抽濾的現(xiàn)象，不利于批量樣品處理。因此，依然有必要開發(fā)一種操作簡便、準確、高效的前處理方法，以滿足快速和批量檢測的需求。

色素的提取試劑多使用水、乙醇-氨水[17-18]和甲醇-水[19]等，研究擬通過對比水提取法、SPE法和50%甲醇溶液提取法3種前處理方法，分析以上方法的優(yōu)缺點，為高效液相色譜法測定水果罐頭中合成著色劑的檢測提供一種新的選擇。

1 試驗部分

1.1 主要材料與試劑

固相萃取柱：Sep-Pak Plus QMA 360 mg（Waters公司）；乙酸銨、氨水、鹽酸（優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、無水乙醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；水（Milipore超純水）；檸檬黃、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍標(biāo)準溶液（0.5 mg/mL，中國計量科學(xué)研究院）。

20 mmol/L乙酸銨溶液：稱取1.54 g乙酸銨溶于1 000 mL水中；無水乙醇-氨水溶液：量取80 mL無水乙醇、1 mL氨水，加水定容至100 mL，混勻；pH 8的50%甲醇溶液：量取50 mL甲醇，加水定容至100 mL，混勻，加氨水調(diào)pH至8；鹽酸-乙醇溶液（1+9）：量取80 mL乙醇、10 mL鹽酸，混勻；50%甲醇溶液：量取50 mL甲醇，加水定容至100 mL，混勻。

3種水果罐頭（黃桃罐頭、什錦罐頭、枇杷罐頭），均為市售。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Agilent 1260液相色譜儀（帶DAD檢測器）（美國Agilent公司）；Thermo Fisher X3R臺式高速冷凍離心機（美國Thermo Fishert公司）；METTLER TOLEDO S220-K-CN pH計（梅特勒-托利多公司）。

1.3 樣品處理

1.3.1 水提取法

稱取2.00 g均勻水果罐頭樣品，置于10 mL離心管中，加入3 mL水，渦旋0.5 min，按4 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，重復(fù)以上操作，將剩余殘渣重復(fù)提取2次，合并上清液于10 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾后，待測。

1.3.2 50 %甲醇溶液提取法

使用50%甲醇溶液作為提取液，其他操作步驟均與水提取法相同，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾后，待測。

1.3.3 SPE法

參照GB/T 21916—2008《水果罐頭中合成著色劑的測定 高效液相色譜法》[6]中的前處理方法，稱取2.00 g均勻水果罐頭樣品，置于50 mL離心管中，加10 mL無水乙醇-氨水溶液，渦旋0.5 min，按4 000 r/min離心10 min，過濾，將剩余殘渣重復(fù)提取3次，合并提取液并在80 ℃水浴中濃縮至約2 mL。將濃縮后的試樣溶液用2%的氨水溶液調(diào)成pH 8后轉(zhuǎn)移到SPE柱中，依次用3 mL pH 8的水和3 mL pH 8的50%甲醇溶液以小于2 mL/min的流速清洗，棄去流出液，再用10 mL鹽酸-乙醇溶液（1+9）將著色劑洗脫出SPE柱，收集全部洗脫液至試管中，用氨水中和，在80 ℃下用氮氣緩緩將洗脫液吹至近干，冷卻后用50%甲醇溶液溶解并定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾后，待測。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：（A）0.02 mol/L乙酸銨水溶液，（B）甲醇；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；檢測波長：檸檬黃、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍分別為428，521，608，509，483，507和625 nm。

1.4.2 梯度洗脫程序

洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫表

1.5 標(biāo)準溶液配制

分別移取400 μL檸檬黃、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍標(biāo)準儲備液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配得合成著色劑標(biāo)準使用液質(zhì)量濃度為20.0 mg/L。用此溶液配制質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.4，1.0，3.0和5.0 mg/L的標(biāo)準系列。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系和檢出限

將標(biāo)準系列按照上述條件進行分析，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準工作曲線，得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見表2。在0.1~5.0 mg/L范圍內(nèi)，各合成著色劑與其色譜峰呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均在0.999以上。

表2 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

將加標(biāo)質(zhì)量濃度逐級稀釋添加于空白樣品中測定信噪比，根據(jù)待測化合物信號與噪音的比值，以譜峰信噪比等于3時對應(yīng)的濃度確定方法檢出限，信噪比等于10時對應(yīng)的濃度確定方法定量限。當(dāng)稱樣量為2.00 g，定容體積為10 mL時，該方法檢出限為0.15 mg/kg，定量限為0.5 mg/kg。

2.2 提取液甲醇溶液體積分數(shù)的選擇

以甲醇溶液作為提取液，其體積分數(shù)的不同致使各著色劑的提取率也有所不同，為了得到較好的回收率，試驗選用10%，30%，50%，70%和90%的甲醇溶液作提取液，進行甲醇溶液體積分數(shù)的篩選，試驗結(jié)果見圖1。由圖1可知，當(dāng)甲醇溶液體積分數(shù)為50%~90%時，各合成著色劑的回收率趨于穩(wěn)定；在SPE法中，最后定容液為50%的甲醇溶液，為了能更直觀地對比，故選用50%的甲醇溶液作為提取液。

圖1 不同體積分數(shù)甲醇溶液的回收率對比

2.3 針式濾器的選用

在高效液相色譜測定中，為防止樣液中潛在的顆粒雜質(zhì)堵塞流路系統(tǒng)及色譜柱，常常需要使用針式濾器過濾待測樣液。然而，針式濾器可能會對色素產(chǎn)生吸附作用，從而影響測定結(jié)果的準確性。為了評估這種影響，以不含合成著色劑的黃桃罐頭為本底，添加1 mg/kg的合成著色劑，并以50%甲醇溶液提取法作為前處理方法，最終提取液分別過0.22 μm水相微孔濾膜和0.22 μm有機相微孔濾膜，上機檢測，測得結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，過水相微孔濾膜的樣液中7種合成著色劑的回收率為82.3%~92.7%；而過有機相微孔濾膜的樣液中的7種合成著色劑中，僅有亮藍有6%的回收率，其他均未檢出。由于市售有機相微孔濾膜的材質(zhì)大多為聚酰胺，這種材質(zhì)對色素有很強的吸附作用，由此推斷，在1 mg/kg的加標(biāo)水平上，7種色素幾乎全部被有機相微孔濾膜吸附住，從而嚴重影響測定結(jié)果的準確性。根據(jù)上述結(jié)果，在樣液過濾時應(yīng)選用0.22 μm水相微孔濾膜。

表3 針式濾器對回收率的影響

2.4 譜圖干擾情況

GB/T 5009.35—2003[16]方法采用254 nm測定各合成著色劑，此法靈敏度不高，且樣品中雜質(zhì)會干擾測定。由紫外-可見掃描光譜可知，7種合成著色劑在紫外和可見波長處均有較大吸收峰，考慮到各著色劑的靈敏度以及樣品基質(zhì)干擾，因此采用多通道檢測，各著色劑選用各自最大的吸收波長來測定，此法不僅大大提高了各合成著色劑的分離度和靈敏度，還能有效地減少雜質(zhì)的干擾。以靛藍為例，以不含合成著色劑的黃桃罐頭為本底，加標(biāo)量為1 mg/L，用50%甲醇溶液提取法前處理，分別在254 nm和608 nm波長下檢測，如圖2所示。靛藍在608 nm波長下靈敏度高、干擾少。

圖2 靛藍加標(biāo)樣品在254 nm和608 nm色譜圖

2.5 3種方法處理樣品的回收率和精密度

以不含合成著色劑的黃桃罐頭為本底，分別加入一定量的標(biāo)準溶液，分別按照2.2小節(jié)的3種前處理方法處理后，用2.3小節(jié)的儀器工作條件進行測定，每個加標(biāo)水平平行測定6次，結(jié)果見表4。由表4可知，水提取法的回收率在為29.0%~87.1%，SRSD為1.77%~4.79%，其中誘惑紅未檢出；50%甲醇溶液提取法的回收率為77.1%~92.8%，SRSD為1.46%~4.42%；SPE法回收率為73.8%~90.3%，SRSD為2.26%~8.21%。由此可見，水提取法回收率整體較低，其中誘惑紅未檢出，該方法不適用于水果罐頭中合成著色劑的測定。50%甲醇溶液提取法和SPE法測定結(jié)果準確，相對標(biāo)準偏差＜5%，兩種方法均能應(yīng)用于水果罐頭中合成著色劑的測定；但前者操作簡便、快速、成本低廉，從經(jīng)濟成本、工作效率的角度考慮，50%甲醇溶液提取法更優(yōu)。

表4 3種方法處理樣品的回收率與精密度試驗結(jié)果（n=6） 單位：%

接表4

2.6 3種基質(zhì)的加標(biāo)回收率和精密度

選用不含有合成著色劑的黃桃罐頭、枇杷罐頭、什錦罐頭為本底，分別加入一定量的標(biāo)準溶液，用2.2.2小節(jié)中50%甲醇溶液提取法前處理，用2.3小節(jié)的儀器工作條件進行測定，每個加標(biāo)水平平行測定6次，結(jié)果見表5，由表5可知，試驗測得黃桃罐頭、枇杷罐頭和什錦罐頭中回收率為77.1%~93.5%，SRSD為1.46%~4.42%，滿足水果罐頭中合成著色劑的檢測要求。

表5 3種基質(zhì)的加標(biāo)回收率與精密度試驗（n=6）單位：%

3 結(jié)論

試驗對比了3種前處理方法在測定水果罐頭中的檸檬黃、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍7種合成著色劑時的優(yōu)缺點，對提取液甲醇溶液體積分數(shù)的選擇、針式濾器的選擇、譜圖干擾情況、方法準確性和精密度進行了討論。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水提取法回收率較差，不適用于水果罐頭中合成著色劑的測定。50%甲醇溶液提取法和SPE法準確度和精密度均滿足方法學(xué)要求，但前者操作更為簡便、快速、成本更為低廉。將50%甲醇溶液提取法應(yīng)用于3種不同水果罐頭中加標(biāo)檢測，7種合成著色劑回收率為77.1%~93.5%，SRSD為1.46%~4.42%，此法準確可靠，重現(xiàn)性好，能夠適用于水果罐頭中7種合成著色劑的快速篩查和批量樣品檢測，為高效液相色譜法測定水果罐頭中合成著色劑的檢測提供一種新的選擇。