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    食物過敏原酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)研究進(jìn)展

    2022-11-16 10:22:01彭斕蘭朱永智李靖桑麗雅王元鳳魏新林
    食品工業(yè) 2022年3期
    關(guān)鍵詞:夾心過敏原過敏

    彭斕蘭,朱永智,李靖,桑麗雅,王元鳳,魏新林*

    1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院(上海 200240);2.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(上海 200240);3.杭州南開日新生物技術(shù)有限公司(杭州 310051)

    食物過敏(food allergy)是指由食物的某種特定成分造成的對食物的不良反應(yīng)[1-3]。食物過敏易難以根治,通常并發(fā)哮喘等特應(yīng)性疾病,在某些情況下甚至威脅生命[4-5]。近年來,隨著食品加工儲(chǔ)運(yùn)和流通的快速發(fā)展,人們的生活環(huán)境和食物類型發(fā)生巨大變化,遭受食物過敏性疾病的人數(shù)大量增加,食物過敏性疾病成為一個(gè)全球性、公眾性的衛(wèi)生問題[6-8]。目前,食物過敏尚無有效的治療手段,只能通過嚴(yán)格避免攝入含有過敏原的食物預(yù)防。

    食物過敏原是導(dǎo)致食物過敏的直接原因,其化學(xué)本質(zhì)是食物中的水溶性或鹽溶性糖蛋白,除果蔬過敏原外,通常具有耐熱、耐酸、耐酶解的特性[9]。據(jù)報(bào)道,具有致敏性的食物有170余種,其中引起重大過敏反應(yīng)的食物主要是牛奶、雞蛋、花生、小麥、大豆、堅(jiān)果類、魚和甲殼類8種[10-12]。對于食物中過敏原的檢測技術(shù)手段主要有體內(nèi)檢測、體外檢測和儀器檢測[13-15]。與體內(nèi)檢測和儀器檢測相比,體外檢測分析技術(shù)在食物過敏中的應(yīng)用更為廣泛。根據(jù)過敏原標(biāo)記物的差異,體外檢測通常是指基于抗原和抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)檢測方法和通過過敏原核酸的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)實(shí)現(xiàn)的檢測法[16]。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是食物過敏原檢測中使用最為廣泛的免疫學(xué)檢測方法之一。隨著食物過敏患者人數(shù)及發(fā)病率的增加,有必要在食品標(biāo)簽中標(biāo)識(shí)食物過敏原,以減少食品過敏患者食用的過敏率,因此檢測食物過敏原,開展食品過敏原檢測方法研究具有重要意義。

    簡要綜述ELISA檢測牛乳、雞蛋、花生等食物過敏原的研究,并對未來發(fā)展趨勢進(jìn)行展望,為促進(jìn)食物過敏原檢測方法的研究和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

    1 酶聯(lián)免疫分析基本理論和原理

    酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA),通過酶促反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)用于檢測和定量溶液中特定物質(zhì)的量。ELISA通常用于檢測抗原,也可用于包括抗體、激素和藥物在內(nèi)的其他物質(zhì)的檢測。

    酶聯(lián)免疫分析的原理具體:在保證抗原(或抗體)免疫活性完整的情況下,將抗原(或抗體)在物理吸附作用下結(jié)合到固體載體表面;在保證酶標(biāo)抗體(酶標(biāo)抗原)的酶活性和免疫活性完整性的前提下,抗體(或抗原)與酶標(biāo)抗原(或酶標(biāo)抗體)在化學(xué)鍵的作用下進(jìn)行偶聯(lián)作用;酶結(jié)合物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后,加入底物,底物在酶的催化作用下變色,通過顏色深淺可以判斷是否存在免疫反應(yīng),以及免疫反應(yīng)性。也可用酶標(biāo)儀測定A450nm,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量檢測分析[17]。酶作為催化劑,起到催化化學(xué)反應(yīng)、放大化學(xué)信號(hào)的作用,提高檢測靈敏度[18]。

    2 酶聯(lián)免疫分析的類型

    為進(jìn)一步提高檢測靈敏度、特異性等優(yōu)勢,衍化出不同的酶聯(lián)免疫吸附測定方法,如夾心ELISA、競爭/抑制ELISA、直接ELISA和間接ELISA等。各類型具備不同特點(diǎn),適用的檢測條件也不同。

    2.1 夾心ELISA

    夾心ELISA需要使用配對抗體(捕獲抗體和檢測抗體),因此每種抗體都需要對抗原的不同且不重疊的區(qū)域或表位具有特異性。夾心ELISA中對匹配的抗體對進(jìn)行特異性測試,確保它們能夠檢測到不同的表位,以達(dá)到準(zhǔn)確的結(jié)果。夾心ELISA的程序:在96孔酶標(biāo)板加入分析物或樣品,用捕獲抗體包被;加入檢測抗體,檢測抗體可以是酶綴合的,在這種情況下,被稱為直接夾心ELISA。如果所使用的檢測抗體未標(biāo)記,則需要第二酶偶聯(lián)的檢測抗體,這被稱為間接夾心ELISA。由于使用了2種抗體檢測抗原,可以同時(shí)使用直接方法和間接方法,夾心ELISA還具有高特異性和靈活性。此外,夾心ELISA靈敏度是直接或間接ELISA的2~5倍。夾心ELISA通常適用于復(fù)雜樣品的分析,因?yàn)榭乖瓱o需在測定前進(jìn)行純化,但結(jié)果仍具有較高的靈敏度和特異性。

    2.2 競爭/抑制ELISA

    競爭/抑制ELISA也稱為封閉ELISA,是一種復(fù)雜技術(shù),適合小抗原。競爭/抑制ELISA主要用于通過檢測預(yù)期信號(hào)輸出中的干擾來測量樣品中抗原或抗體的濃度。本質(zhì)上,樣品抗原或抗體分別與參照物競爭結(jié)合有限量的標(biāo)記抗體或抗原。樣品抗原濃度越高,輸出信號(hào)越弱,表明信號(hào)輸出與樣品中抗原量呈反比。這種形式最適合不能同時(shí)結(jié)合兩種抗體的低分子量化合物。測試線無顏色表示分析物的存在,而測試線和對照線均顯示顏色表示陰性結(jié)果。

    2.3 直接ELISA

    直接ELISA檢測比其他ELISA所需的步驟更少,不需要潛在的交叉反應(yīng)的第二抗體,檢測要快得多,也不太容易出錯(cuò)。由于抗原的固定不是特異性的,因此直接ELISA可以觀察到更高的背景噪音,樣品中的所有蛋白質(zhì)(包括目標(biāo)蛋白質(zhì))都會(huì)結(jié)合到酶標(biāo)板上,而每種靶蛋白都需要特異性的偶聯(lián)一抗,因此,直接ELISA的靈活性較差。直接ELISA不使用二抗,沒有信號(hào)放大,檢測的靈敏度不高。當(dāng)需要分析對抗原的免疫反應(yīng)時(shí),通常使用直接ELISA技術(shù)。

    2.4 間接ELISA

    間接ELISA是將抗原包被吸附到96孔酶標(biāo)板中。檢測時(shí),未標(biāo)記的一抗結(jié)合至特定抗原,應(yīng)用針對一抗的宿主物種的酶綴合的二抗。間接ELISA具有更高的靈敏度,因?yàn)椴煌囊豢箍膳c單個(gè)標(biāo)記的二抗一起使用。此外,間接ELISA需要的標(biāo)記抗體更少,因而更經(jīng)濟(jì)。但是二抗與包被的抗原有可能發(fā)生交叉反應(yīng),或許會(huì)增加背景噪音。由于需要額外的二抗孵育步驟,間接ELISA分析比直接ELISA花費(fèi)的時(shí)間更長。間接ELISA通常用于檢測確定樣品中的總抗體濃度。

    3 食物過敏原酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)研究進(jìn)展

    牛乳是八大主要過敏性食物之一,在食品加工中被廣泛添加到各類食品中,因此研究牛乳過敏原的檢測方法十分必要。盡管牛乳中的致敏蛋白質(zhì)超過30種,但是酪蛋白和乳清蛋白被認(rèn)為是主要過敏原[27]。β-乳球蛋白在牛乳總蛋白(10%)和乳清蛋白(50%)中的占比很高,牛乳過敏患者中對β-乳球蛋白過敏的人數(shù)占比約82%[19]。因此,β-乳球蛋白的免疫學(xué)檢測方法研究受到科研工作者的關(guān)注。為檢測β-乳球蛋白,陳獻(xiàn)雄等[20]以β-乳球蛋白免疫BALB/c小鼠,建立可檢測β-乳球蛋白的雙單克隆抗體夾心法ELISA。該方法在15.63~50 ng/mL范圍內(nèi)線性良好。袁水林等[21]以β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為包被抗原,以自制抗體為一抗,以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG:HRP為二抗,以鄰苯二胺為底物,建立一種間接競爭ELISA(線性檢測范圍為1~1×103ng/mL),反相高效液相色譜法(RP-HPLC)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明2種方法的檢測結(jié)果具有良好一致性。與陳獻(xiàn)雄等[20]的方法相比,該方法檢測β-乳球蛋白線性范圍更寬,檢出低線更低,因此,檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確,適用性更強(qiáng)。除β-乳球蛋白外,α-乳白蛋白也是牛乳中常見的過敏原,部分敏感人群對2種甚至多種牛乳過敏原敏感。張忠華[22]以牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白免疫新西蘭大白兔,優(yōu)化ELISA條件,建立牛乳β-乳球蛋白和α-乳白蛋白檢測的間接競爭ELISA,其最適檢測范圍分別為10~1×103ng/mL和50~1×103ng/mL。為了研究食品熱加工對食物過敏原致敏性的影響,Negroni等[23]制備針對熱處理和天然β-乳球蛋白的單克隆抗體,分別建立可檢測食品中熱處理和天然β-乳球蛋白的夾心ELISA方法,該方法對天然β-乳球蛋白和熱處理過的β-乳球蛋白的檢測范圍分別為0.05~5 ng/mL和0.2~20 ng/mL,2種方法的檢出限和檢測范圍有明顯區(qū)別,可能是熱處理導(dǎo)致β-乳球蛋白的致敏位點(diǎn)變化,影響其致敏性。

    雞蛋被譽(yù)為“全營養(yǎng)食品”是重要的營養(yǎng)來源。然而,食用雞蛋及其制品也常引發(fā)過敏反應(yīng),患病率在1%~2%[24],蛋清和蛋黃均含有過敏原[25-26],但是蛋清更容易引起過敏反應(yīng)[27]。常見的、致敏性較強(qiáng)的雞蛋過敏原通常是指卵白蛋白和卵類黏蛋白[25]。張世偉等[28]建立以單克隆抗體為包被抗體、多克隆抗體(辣根過氧化物酶標(biāo)記)為二抗的卵白蛋白雙抗夾心ELISA方法,該方法檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠(檢出限10 ng/mL,IC50260 ng/mL),基本可以滿足食品中雞蛋過敏原準(zhǔn)確、快速檢測的需要。梁汭[29]通過間接EILSA或競爭抑制ELISA檢測去折疊前后卵類黏蛋白的兔血清IgG結(jié)合能力和雞蛋過敏患者血清IgE結(jié)合能力,以評估糖化卵類黏蛋白的免疫反應(yīng)性,尋求通過食品級加工技術(shù)獲得低致敏卵類黏蛋白產(chǎn)物,探究其表位與致敏性變化的關(guān)系,為低致敏或脫敏雞蛋產(chǎn)品的研發(fā)提供理論指導(dǎo)。

    花生富含不飽和脂肪酸,具有很高的營養(yǎng)價(jià)值,是重要的油料作物之一[30]。但花生也是常見的八類致敏食物之一,花生導(dǎo)致的過敏在成年人中的發(fā)病率高達(dá)4%~8%[31-33]。吉坤美等[34]通過花生總蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體,建立可特異性檢測食品中花生過敏原的雙多抗體夾心ELISA試劑,該方法具有較低的檢出限(8 ng/mL),用該方法檢測產(chǎn)自中國、美國和日本等地的15種食品并與相應(yīng)的食品標(biāo)簽對比,絕大部分食品的檢測結(jié)果符合過敏原標(biāo)注。高純度的花生過敏原Arah6用于免疫新西蘭大白兔,制備多克隆抗體,建立間接競爭ELISA,其中包被原為高純度的Arah6,自制抗體作為一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗,該檢測方法適用于食品中花生現(xiàn)場快速檢測[35]。盡管加熱會(huì)改變食物原料中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),但仍是食品加工中最常用的方式。在免疫學(xué)方法檢測食物過敏原時(shí),加熱同樣會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)(過敏原)的結(jié)構(gòu)變化,致使抗體無法正確識(shí)別被檢測的過敏原,產(chǎn)生假陰性現(xiàn)象[36]。周紅菲[37]采用不同的熱加工方式處理新鮮花生、分離花生蛋白,利用質(zhì)譜分析酶解肽段信息,結(jié)合相應(yīng)過敏原蛋白的空間結(jié)構(gòu)模型和過敏原表位,分析其空間結(jié)構(gòu)和潛在致敏性的變化。

    全世界35%~40%的人口以小麥為主糧,近年來小麥過敏原誘發(fā)食物過敏癥的發(fā)病率正在逐年升高[38]。一般來說,小麥過敏可引發(fā)過面包師哮喘癥、敏性休克等癥狀,嚴(yán)重時(shí)還有生命危險(xiǎn)[39]。ELISA方法是檢測小麥過敏原常用的方法之一,具有簡便快速、靈敏的優(yōu)勢[39]。但是,由于樣品容易交叉污染,導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果頻繁出現(xiàn),降低了過敏原定量檢測的準(zhǔn)確率[40]。Diaz-Amigo等[41]還發(fā)現(xiàn)抗體特異性、提取程序、參考材料及其結(jié)構(gòu)相似物均對ELISA檢測結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響,ELISA檢測面筋蛋白的測定限在mg/kg量級。趙凱等[42]用自制小麥球蛋白單克隆抗體和多克隆抗體,建立一種不與其他物種的蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的雙抗夾心ELISA方法,該方法的特異性和靈敏度良好。

    大豆及其副產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值高、物理化學(xué)性質(zhì)良好,是食品工業(yè)中不可或缺的油料作物和植物蛋白質(zhì)來源。大豆是常見的八類過敏性食物之一,大豆過敏原的研究備受關(guān)注[43]。大豆球蛋白被認(rèn)為是大豆中主要的過敏原,將純化的大豆球蛋白作為免疫原制備單克隆抗體,開發(fā)出一種競爭性ELISA方法,該方法重現(xiàn)性良好,可靈敏地測定大豆球蛋白用于評估食品中的大豆過敏性[43]。布冠好等[44]通過大豆球蛋白(純品)免疫新西蘭大白兔,制備兔抗大豆球蛋白多克隆抗體,建立可特異性檢測大豆球蛋白的間接競爭ELISA法。該方法的具有一定靈敏度和重復(fù)性,線性范圍為0.01~0.05 μg/mL,可用于大豆蛋白制品過敏原的檢測。

    4 結(jié)語與展望

    近年來,食物過敏的發(fā)病率逐年增長,過敏人群的生活受到嚴(yán)重影響。以抗原抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫法能夠快速、準(zhǔn)確地對食物過敏原進(jìn)行定性和定量分析,還可以檢測天然蛋白質(zhì)和酶解的蛋白質(zhì)片段。針對牛奶、雞蛋、花生、小麥、大豆等常見過敏性食物的酶聯(lián)免疫檢測方法逐步得到建立和完善,并且在食物過敏原的檢測中發(fā)揮重要作用。

    酶聯(lián)免疫法研究的關(guān)鍵在于致敏蛋白抗體的制備,優(yōu)質(zhì)的抗體能夠保障檢測方法的特異性,應(yīng)用新型納米材料或標(biāo)記物,或許能夠豐富酶聯(lián)免疫法的類型。在食物過敏原的研究方面,篩選不同食物原料的標(biāo)志性過敏原,解析其結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特性,明晰特定致敏位點(diǎn),檢測食物過敏原的致敏性殘基,降低高溫等加工工藝和食物過敏原交叉反應(yīng)對檢測結(jié)果的影響等,是未來研究的重要方向,不僅可以為建立健全食品標(biāo)簽中過敏原標(biāo)識(shí)體系提供支撐,還可以指導(dǎo)低致敏食品的研發(fā)。

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