食物過敏原酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)研究進(jìn)展

彭斕蘭，朱永智，李靖，桑麗雅，王元鳳，魏新林*

1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院（上海 200240）；2.上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（上海 200240）；3.杭州南開日新生物技術(shù)有限公司（杭州 310051）

食物過敏（food allergy）是指由食物的某種特定成分造成的對食物的不良反應(yīng)[1-3]。食物過敏易難以根治，通常并發(fā)哮喘等特應(yīng)性疾病，在某些情況下甚至威脅生命[4-5]。近年來，隨著食品加工儲(chǔ)運(yùn)和流通的快速發(fā)展，人們的生活環(huán)境和食物類型發(fā)生巨大變化，遭受食物過敏性疾病的人數(shù)大量增加，食物過敏性疾病成為一個(gè)全球性、公眾性的衛(wèi)生問題[6-8]。目前，食物過敏尚無有效的治療手段，只能通過嚴(yán)格避免攝入含有過敏原的食物預(yù)防。

食物過敏原是導(dǎo)致食物過敏的直接原因，其化學(xué)本質(zhì)是食物中的水溶性或鹽溶性糖蛋白，除果蔬過敏原外，通常具有耐熱、耐酸、耐酶解的特性[9]。據(jù)報(bào)道，具有致敏性的食物有170余種，其中引起重大過敏反應(yīng)的食物主要是牛奶、雞蛋、花生、小麥、大豆、堅(jiān)果類、魚和甲殼類8種[10-12]。對于食物中過敏原的檢測技術(shù)手段主要有體內(nèi)檢測、體外檢測和儀器檢測[13-15]。與體內(nèi)檢測和儀器檢測相比，體外檢測分析技術(shù)在食物過敏中的應(yīng)用更為廣泛。根據(jù)過敏原標(biāo)記物的差異，體外檢測通常是指基于抗原和抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)檢測方法和通過過敏原核酸的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）實(shí)現(xiàn)的檢測法[16]。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是食物過敏原檢測中使用最為廣泛的免疫學(xué)檢測方法之一。隨著食物過敏患者人數(shù)及發(fā)病率的增加，有必要在食品標(biāo)簽中標(biāo)識(shí)食物過敏原，以減少食品過敏患者食用的過敏率，因此檢測食物過敏原，開展食品過敏原檢測方法研究具有重要意義。

簡要綜述ELISA檢測牛乳、雞蛋、花生等食物過敏原的研究，并對未來發(fā)展趨勢進(jìn)行展望，為促進(jìn)食物過敏原檢測方法的研究和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 酶聯(lián)免疫分析基本理論和原理

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA），通過酶促反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)用于檢測和定量溶液中特定物質(zhì)的量。ELISA通常用于檢測抗原，也可用于包括抗體、激素和藥物在內(nèi)的其他物質(zhì)的檢測。

酶聯(lián)免疫分析的原理具體：在保證抗原（或抗體）免疫活性完整的情況下，將抗原（或抗體）在物理吸附作用下結(jié)合到固體載體表面；在保證酶標(biāo)抗體（酶標(biāo)抗原）的酶活性和免疫活性完整性的前提下，抗體（或抗原）與酶標(biāo)抗原（或酶標(biāo)抗體）在化學(xué)鍵的作用下進(jìn)行偶聯(lián)作用；酶結(jié)合物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，加入底物，底物在酶的催化作用下變色，通過顏色深淺可以判斷是否存在免疫反應(yīng)，以及免疫反應(yīng)性。也可用酶標(biāo)儀測定A450nm，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量檢測分析[17]。酶作為催化劑，起到催化化學(xué)反應(yīng)、放大化學(xué)信號(hào)的作用，提高檢測靈敏度[18]。

2 酶聯(lián)免疫分析的類型

為進(jìn)一步提高檢測靈敏度、特異性等優(yōu)勢，衍化出不同的酶聯(lián)免疫吸附測定方法，如夾心ELISA、競爭/抑制ELISA、直接ELISA和間接ELISA等。各類型具備不同特點(diǎn)，適用的檢測條件也不同。

2.1 夾心ELISA

夾心ELISA需要使用配對抗體（捕獲抗體和檢測抗體），因此每種抗體都需要對抗原的不同且不重疊的區(qū)域或表位具有特異性。夾心ELISA中對匹配的抗體對進(jìn)行特異性測試，確保它們能夠檢測到不同的表位，以達(dá)到準(zhǔn)確的結(jié)果。夾心ELISA的程序：在96孔酶標(biāo)板加入分析物或樣品，用捕獲抗體包被；加入檢測抗體，檢測抗體可以是酶綴合的，在這種情況下，被稱為直接夾心ELISA。如果所使用的檢測抗體未標(biāo)記，則需要第二酶偶聯(lián)的檢測抗體，這被稱為間接夾心ELISA。由于使用了2種抗體檢測抗原，可以同時(shí)使用直接方法和間接方法，夾心ELISA還具有高特異性和靈活性。此外，夾心ELISA靈敏度是直接或間接ELISA的2~5倍。夾心ELISA通常適用于復(fù)雜樣品的分析，因?yàn)榭乖瓱o需在測定前進(jìn)行純化，但結(jié)果仍具有較高的靈敏度和特異性。

2.2 競爭/抑制ELISA

競爭/抑制ELISA也稱為封閉ELISA，是一種復(fù)雜技術(shù)，適合小抗原。競爭/抑制ELISA主要用于通過檢測預(yù)期信號(hào)輸出中的干擾來測量樣品中抗原或抗體的濃度。本質(zhì)上，樣品抗原或抗體分別與參照物競爭結(jié)合有限量的標(biāo)記抗體或抗原。樣品抗原濃度越高，輸出信號(hào)越弱，表明信號(hào)輸出與樣品中抗原量呈反比。這種形式最適合不能同時(shí)結(jié)合兩種抗體的低分子量化合物。測試線無顏色表示分析物的存在，而測試線和對照線均顯示顏色表示陰性結(jié)果。

2.3 直接ELISA

直接ELISA檢測比其他ELISA所需的步驟更少，不需要潛在的交叉反應(yīng)的第二抗體，檢測要快得多，也不太容易出錯(cuò)。由于抗原的固定不是特異性的，因此直接ELISA可以觀察到更高的背景噪音，樣品中的所有蛋白質(zhì)（包括目標(biāo)蛋白質(zhì)）都會(huì)結(jié)合到酶標(biāo)板上，而每種靶蛋白都需要特異性的偶聯(lián)一抗，因此，直接ELISA的靈活性較差。直接ELISA不使用二抗，沒有信號(hào)放大，檢測的靈敏度不高。當(dāng)需要分析對抗原的免疫反應(yīng)時(shí)，通常使用直接ELISA技術(shù)。

2.4 間接ELISA

間接ELISA是將抗原包被吸附到96孔酶標(biāo)板中。檢測時(shí)，未標(biāo)記的一抗結(jié)合至特定抗原，應(yīng)用針對一抗的宿主物種的酶綴合的二抗。間接ELISA具有更高的靈敏度，因?yàn)椴煌囊豢箍膳c單個(gè)標(biāo)記的二抗一起使用。此外，間接ELISA需要的標(biāo)記抗體更少，因而更經(jīng)濟(jì)。但是二抗與包被的抗原有可能發(fā)生交叉反應(yīng)，或許會(huì)增加背景噪音。由于需要額外的二抗孵育步驟，間接ELISA分析比直接ELISA花費(fèi)的時(shí)間更長。間接ELISA通常用于檢測確定樣品中的總抗體濃度。

3 食物過敏原酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)研究進(jìn)展

牛乳是八大主要過敏性食物之一，在食品加工中被廣泛添加到各類食品中，因此研究牛乳過敏原的檢測方法十分必要。盡管牛乳中的致敏蛋白質(zhì)超過30種，但是酪蛋白和乳清蛋白被認(rèn)為是主要過敏原[27]。β-乳球蛋白在牛乳總蛋白（10%）和乳清蛋白（50%）中的占比很高，牛乳過敏患者中對β-乳球蛋白過敏的人數(shù)占比約82%[19]。因此，β-乳球蛋白的免疫學(xué)檢測方法研究受到科研工作者的關(guān)注。為檢測β-乳球蛋白，陳獻(xiàn)雄等[20]以β-乳球蛋白免疫BALB/c小鼠，建立可檢測β-乳球蛋白的雙單克隆抗體夾心法ELISA。該方法在15.63~50 ng/mL范圍內(nèi)線性良好。袁水林等[21]以β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為包被抗原，以自制抗體為一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG：HRP為二抗，以鄰苯二胺為底物，建立一種間接競爭ELISA（線性檢測范圍為1~1×103ng/mL），反相高效液相色譜法（RP-HPLC）進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明2種方法的檢測結(jié)果具有良好一致性。與陳獻(xiàn)雄等[20]的方法相比，該方法檢測β-乳球蛋白線性范圍更寬，檢出低線更低，因此，檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確，適用性更強(qiáng)。除β-乳球蛋白外，α-乳白蛋白也是牛乳中常見的過敏原，部分敏感人群對2種甚至多種牛乳過敏原敏感。張忠華[22]以牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白免疫新西蘭大白兔，優(yōu)化ELISA條件，建立牛乳β-乳球蛋白和α-乳白蛋白檢測的間接競爭ELISA，其最適檢測范圍分別為10~1×103ng/mL和50~1×103ng/mL。為了研究食品熱加工對食物過敏原致敏性的影響，Negroni等[23]制備針對熱處理和天然β-乳球蛋白的單克隆抗體，分別建立可檢測食品中熱處理和天然β-乳球蛋白的夾心ELISA方法，該方法對天然β-乳球蛋白和熱處理過的β-乳球蛋白的檢測范圍分別為0.05~5 ng/mL和0.2~20 ng/mL，2種方法的檢出限和檢測范圍有明顯區(qū)別，可能是熱處理導(dǎo)致β-乳球蛋白的致敏位點(diǎn)變化，影響其致敏性。

雞蛋被譽(yù)為“全營養(yǎng)食品”是重要的營養(yǎng)來源。然而，食用雞蛋及其制品也常引發(fā)過敏反應(yīng)，患病率在1%~2%[24]，蛋清和蛋黃均含有過敏原[25-26]，但是蛋清更容易引起過敏反應(yīng)[27]。常見的、致敏性較強(qiáng)的雞蛋過敏原通常是指卵白蛋白和卵類黏蛋白[25]。張世偉等[28]建立以單克隆抗體為包被抗體、多克隆抗體（辣根過氧化物酶標(biāo)記）為二抗的卵白蛋白雙抗夾心ELISA方法，該方法檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠（檢出限10 ng/mL，IC50260 ng/mL），基本可以滿足食品中雞蛋過敏原準(zhǔn)確、快速檢測的需要。梁汭[29]通過間接EILSA或競爭抑制ELISA檢測去折疊前后卵類黏蛋白的兔血清IgG結(jié)合能力和雞蛋過敏患者血清IgE結(jié)合能力，以評估糖化卵類黏蛋白的免疫反應(yīng)性，尋求通過食品級加工技術(shù)獲得低致敏卵類黏蛋白產(chǎn)物，探究其表位與致敏性變化的關(guān)系，為低致敏或脫敏雞蛋產(chǎn)品的研發(fā)提供理論指導(dǎo)。

花生富含不飽和脂肪酸，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，是重要的油料作物之一[30]。但花生也是常見的八類致敏食物之一，花生導(dǎo)致的過敏在成年人中的發(fā)病率高達(dá)4%~8%[31-33]。吉坤美等[34]通過花生總蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體，建立可特異性檢測食品中花生過敏原的雙多抗體夾心ELISA試劑，該方法具有較低的檢出限（8 ng/mL），用該方法檢測產(chǎn)自中國、美國和日本等地的15種食品并與相應(yīng)的食品標(biāo)簽對比，絕大部分食品的檢測結(jié)果符合過敏原標(biāo)注。高純度的花生過敏原Arah6用于免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，建立間接競爭ELISA，其中包被原為高純度的Arah6，自制抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，該檢測方法適用于食品中花生現(xiàn)場快速檢測[35]。盡管加熱會(huì)改變食物原料中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但仍是食品加工中最常用的方式。在免疫學(xué)方法檢測食物過敏原時(shí)，加熱同樣會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)（過敏原）的結(jié)構(gòu)變化，致使抗體無法正確識(shí)別被檢測的過敏原，產(chǎn)生假陰性現(xiàn)象[36]。周紅菲[37]采用不同的熱加工方式處理新鮮花生、分離花生蛋白，利用質(zhì)譜分析酶解肽段信息，結(jié)合相應(yīng)過敏原蛋白的空間結(jié)構(gòu)模型和過敏原表位，分析其空間結(jié)構(gòu)和潛在致敏性的變化。

全世界35%~40%的人口以小麥為主糧，近年來小麥過敏原誘發(fā)食物過敏癥的發(fā)病率正在逐年升高[38]。一般來說，小麥過敏可引發(fā)過面包師哮喘癥、敏性休克等癥狀，嚴(yán)重時(shí)還有生命危險(xiǎn)[39]。ELISA方法是檢測小麥過敏原常用的方法之一，具有簡便快速、靈敏的優(yōu)勢[39]。但是，由于樣品容易交叉污染，導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果頻繁出現(xiàn)，降低了過敏原定量檢測的準(zhǔn)確率[40]。Diaz-Amigo等[41]還發(fā)現(xiàn)抗體特異性、提取程序、參考材料及其結(jié)構(gòu)相似物均對ELISA檢測結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響，ELISA檢測面筋蛋白的測定限在mg/kg量級。趙凱等[42]用自制小麥球蛋白單克隆抗體和多克隆抗體，建立一種不與其他物種的蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的雙抗夾心ELISA方法，該方法的特異性和靈敏度良好。

大豆及其副產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值高、物理化學(xué)性質(zhì)良好，是食品工業(yè)中不可或缺的油料作物和植物蛋白質(zhì)來源。大豆是常見的八類過敏性食物之一，大豆過敏原的研究備受關(guān)注[43]。大豆球蛋白被認(rèn)為是大豆中主要的過敏原，將純化的大豆球蛋白作為免疫原制備單克隆抗體，開發(fā)出一種競爭性ELISA方法，該方法重現(xiàn)性良好，可靈敏地測定大豆球蛋白用于評估食品中的大豆過敏性[43]。布冠好等[44]通過大豆球蛋白（純品）免疫新西蘭大白兔，制備兔抗大豆球蛋白多克隆抗體，建立可特異性檢測大豆球蛋白的間接競爭ELISA法。該方法的具有一定靈敏度和重復(fù)性，線性范圍為0.01~0.05 μg/mL，可用于大豆蛋白制品過敏原的檢測。

4 結(jié)語與展望

近年來，食物過敏的發(fā)病率逐年增長，過敏人群的生活受到嚴(yán)重影響。以抗原抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫法能夠快速、準(zhǔn)確地對食物過敏原進(jìn)行定性和定量分析，還可以檢測天然蛋白質(zhì)和酶解的蛋白質(zhì)片段。針對牛奶、雞蛋、花生、小麥、大豆等常見過敏性食物的酶聯(lián)免疫檢測方法逐步得到建立和完善，并且在食物過敏原的檢測中發(fā)揮重要作用。

酶聯(lián)免疫法研究的關(guān)鍵在于致敏蛋白抗體的制備，優(yōu)質(zhì)的抗體能夠保障檢測方法的特異性，應(yīng)用新型納米材料或標(biāo)記物，或許能夠豐富酶聯(lián)免疫法的類型。在食物過敏原的研究方面，篩選不同食物原料的標(biāo)志性過敏原，解析其結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特性，明晰特定致敏位點(diǎn)，檢測食物過敏原的致敏性殘基，降低高溫等加工工藝和食物過敏原交叉反應(yīng)對檢測結(jié)果的影響等，是未來研究的重要方向，不僅可以為建立健全食品標(biāo)簽中過敏原標(biāo)識(shí)體系提供支撐，還可以指導(dǎo)低致敏食品的研發(fā)。