可視化蛋白芯片在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用

孟東，陳蕾，王波，墨瑾瑜，李周敏*

1.徐州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心（徐州 221008）；2.南京大學(xué)金陵學(xué)院（南京 210089）

常言道“民以食為天”，食品安全問(wèn)題與社會(huì)中每一個(gè)群體都有著密不可分的關(guān)系。目前食品安全檢測(cè)方法越來(lái)越多樣化、簡(jiǎn)便化、有效化，并在最大程度上對(duì)食品安全起到了保障作用[1]。蛋白芯片技術(shù)以基因芯片為基礎(chǔ)，采用微陣列點(diǎn)樣等方法，將大量生物樣品（抗原抗體等）有序地固定在載體上，形成較密集的二維分子陣列。待測(cè)生物樣品被檢測(cè)過(guò)程中，使其與標(biāo)記好的檢測(cè)探針實(shí)現(xiàn)特異性反應(yīng)，然后用熒光法、化學(xué)發(fā)光法、顯色法等來(lái)顯示特異性反應(yīng)結(jié)果，最后利用特定的儀器設(shè)備快速檢測(cè)出信號(hào)強(qiáng)度，并準(zhǔn)確且高效分析，從而判斷出樣品中靶分子的含量，以達(dá)到對(duì)樣品檢測(cè)分析的結(jié)果[2-6]。

蛋白芯片技術(shù)有著操作簡(jiǎn)單靈敏度高、所需樣品少、一份樣品可同時(shí)進(jìn)行多指標(biāo)檢測(cè)、提升檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本等優(yōu)點(diǎn)[7]。文章著重于可視化蛋白芯片技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用，包括食源性致病微生物、獸藥殘留、農(nóng)藥殘留、動(dòng)物疫病等方面進(jìn)行綜述。

1 可視化蛋白芯片在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用

1.1 食源性致病微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

食源性致病微生物對(duì)食品的污染，不但會(huì)威脅到人民群眾的身體健康，而且也會(huì)給國(guó)民經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大的損失。目前現(xiàn)有的食源性致病微生物的檢測(cè)方法操作過(guò)程繁鎖、檢測(cè)周期長(zhǎng)?？梢暬鞍仔酒梢钥焖俚貦z測(cè)出食品中潛在的微生物，又兼?zhèn)渲Ｒ?guī)芯片的優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，許多學(xué)者開(kāi)始用可視化蛋白芯片對(duì)病原菌展開(kāi)一系列檢測(cè)研究。

熊亮斌等[8]在檢測(cè)西瓜中果斑病菌時(shí)，用的是在硝酸纖維素膜上制備的可視化蛋白芯片，其檢測(cè)結(jié)果表明，可視化蛋白芯片具有較好的特異性，可進(jìn)行多次檢測(cè)樣品。相比于常用的檢測(cè)方法，如酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），其高靈敏度和陽(yáng)性檢測(cè)率一致，但可視化蛋白芯片具有檢測(cè)速度更快，檢測(cè)時(shí)間僅為ELISA的1/8，樣品量少，操作設(shè)備更簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果不需要昂貴的儀器，僅用肉眼所見(jiàn)或顯微鏡下觀察等優(yōu)點(diǎn)。

胡娟等[9]在進(jìn)行檢測(cè)黃瓜綠斑駁花葉病毒時(shí)，用的也是在硝酸纖維素膜上制備的可視化蛋白芯片。試驗(yàn)中，以50批葫蘆科種子為待測(cè)樣品，用在硝酸纖維素膜上制備的可視化蛋白芯片進(jìn)行檢測(cè)，最后其檢測(cè)結(jié)果與ELISA相比較，吻合率基本一致，并經(jīng)過(guò)PCR的檢驗(yàn)后，證實(shí)用可視化蛋白芯片所測(cè)定的結(jié)果良好。這也說(shuō)明了可視化蛋白芯片在植物病毒檢測(cè)中能廣泛應(yīng)用。

1.2 在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的種類(lèi)繁多。我國(guó)獸藥種類(lèi)主要包括抗生素類(lèi)、激素和興奮劑類(lèi)等藥物。常見(jiàn)的獸藥殘留檢測(cè)方法主要包括微生物法[10]、理化檢測(cè)法[11]、免疫分析法[12]等。這些方法雖然具有高特異性、高靈敏度、操作容易等優(yōu)點(diǎn)，但是在獸藥殘留檢測(cè)中仍需要更準(zhǔn)確、更省時(shí)、無(wú)需依賴(lài)昂貴的儀器設(shè)備的檢測(cè)方法。

鐘文英等[13]利用可視化蛋白芯片，同時(shí)檢測(cè)牛乳中殘留的兩類(lèi)抗生素（磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)）。其檢測(cè)結(jié)果顯示，在牛乳中2種藥物的回收率，分別在83%~110%之間，且相對(duì)偏差可控制在10%以?xún)?nèi)。也能快速篩選出對(duì)牛乳樣本中磺胺類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗生素的殘留。李周敏等[14]采用可視化蛋白技術(shù)也能快速檢測(cè)出牛奶中的慶大霉素。所得結(jié)果表明，慶大霉素加標(biāo)的質(zhì)量濃度分別在10，200和1 000 ng/mL（n=3）這三個(gè)數(shù)值左右，且平均回收率達(dá)到112%，98%和95%。此外李周敏等[15-16]也采用了可視化蛋白技術(shù)同時(shí)檢測(cè)牛奶中9種喹諾酮類(lèi)抗生素以及同時(shí)檢測(cè)牛奶中諾氟沙星和惡喹酸，其結(jié)果表明試驗(yàn)所購(gòu)的16個(gè)品牌牛奶樣品中，喹諾酮類(lèi)抗生素含量均低于1 ng/mL，符合國(guó)家對(duì)牛奶最大允許殘留量的規(guī)定。Li等[17-19]還建立了可視化蛋白芯片法同時(shí)檢測(cè)牛奶中多種有害物質(zhì)的殘留。

王興如等[20]利用自動(dòng)化微孔板生物芯片點(diǎn)樣儀與可視化檢測(cè)方法相結(jié)合，采用內(nèi)標(biāo)法實(shí)現(xiàn)蜂蜜中四環(huán)素的單孔定量檢測(cè)。每孔內(nèi)均含內(nèi)標(biāo)校正曲線，可避免人為孔間加樣帶來(lái)的結(jié)果誤差。該法可用于多個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)且整個(gè)過(guò)程操作簡(jiǎn)便，適宜于日?？焖贆z測(cè)。該法的檢測(cè)限達(dá)到0.8 ng/mL，線性范圍為0.8~19.2 ng/mL，R2=0.971，回收率達(dá)到80%~120%，SRSD＜10%。王雯等[21]在研究中發(fā)現(xiàn)，采用可視化蛋白芯片能十分快速地測(cè)定出氯霉素在蜂蜜中的殘留，且檢測(cè)效率快，可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，樣品的回收率也在90%~120%，檢出限低于0.1 ng/mL，效果十分良好。Li等[22]建立了可視化蛋白芯片法同時(shí)檢測(cè)蜂蜜中4種硝基呋喃代謝物的殘留含量。此方法還可以運(yùn)用在對(duì)現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模待測(cè)樣品進(jìn)行初篩選階段。

李周敏等[23]還通過(guò)可視化蛋白芯片對(duì)飼料中常見(jiàn)的抗生素（四環(huán)素、林可霉素、氟苯尼考等）進(jìn)行檢測(cè)。方法的加標(biāo)回收率均在70%~120%內(nèi)，SRSD均小于15%。試驗(yàn)結(jié)果與液相色譜-質(zhì)譜連用的方法相比，兩者之間基本一致，而且可視化蛋白芯片檢測(cè)效率更快，具有操作更簡(jiǎn)單、可同時(shí)進(jìn)行大量樣品一起檢測(cè)、樣品量少等優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，可視化蛋白芯片法具有高通量、可同時(shí)進(jìn)行多樣品檢測(cè)分析、高靈敏度、試劑用量少、檢測(cè)成本低、檢測(cè)效率快等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物源性食品中獸藥殘留檢測(cè)應(yīng)用中能夠廣泛應(yīng)用。

1.3 在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

農(nóng)藥殘留是指農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中食品（豆類(lèi)、蔬果、禽肉等）施用農(nóng)藥后仍有殘留少量農(nóng)藥，有毒降解物等有毒雜質(zhì)。若誤食用含農(nóng)藥殘留的食品，不僅會(huì)食物中毒，而且也會(huì)對(duì)人體造成慢性危害。其中，有機(jī)氯農(nóng)藥在人體內(nèi)代謝功能差，體內(nèi)累積時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)人們的身體傷害較大。目前，在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中常用的檢測(cè)方法主要有：氣相色譜法[24]、液相色譜法[25]、酶抑制法[26]、免疫法[27]等。

孟東等[28]建立了可視化微陣列蛋白芯片法同時(shí)檢測(cè)蜂蜜中多菌靈、啶蟲(chóng)脒、蠅毒磷3種農(nóng)藥殘留含量的分析方法。對(duì)多菌靈、啶蟲(chóng)脒、蠅毒磷的定量范圍分別為0.4~6.4，0.3~4.8和0.75~12 ng/mL，相關(guān)系數(shù)r＞0.99，檢測(cè)限分別為3.21，2.47和2.52 ng/mL，準(zhǔn)確度為83.6%~126.4%，變異系數(shù)均＜10%，且三者之間交叉反應(yīng)率低；向不同的空白蜂蜜中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，檢測(cè)結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。

湯迪朋等[29]建立基于可視化蛋白芯片法智能手機(jī)同時(shí)快速檢測(cè)蔬菜中3種農(nóng)藥殘留的分析方法。對(duì)多菌靈、百菌清、克百威的定量范圍分別為3~243，3~243和0.5~8 ng/mL，相關(guān)系數(shù)r＞0.99，且三者之間的交叉反應(yīng)率均＜1%；向不同的空白蔬菜中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，檢測(cè)結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，加標(biāo)回收率為84.0%~118.0%，變異系數(shù)均＜10%（n=3）；檢測(cè)限分別為79，69和15 ng/mL。

1.4 在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用

在食品安全檢測(cè)中，動(dòng)物疫病檢測(cè)是保證食品安全的一個(gè)重要步驟。動(dòng)物疫病本意上是指動(dòng)物出現(xiàn)傳染病或者寄生蟲(chóng)病毒等癥狀，常出現(xiàn)的動(dòng)物疫病包括牛瘟、雞瘟、豬瘟等。養(yǎng)雞業(yè)主要的幾種傳染病有禽流感、新城疫病、雞傳染性支氣管炎等。人們食用攜帶有病毒感染的禽肉后，輕者會(huì)出現(xiàn)嘔吐、惡心、全身乏力等病狀，重者可能會(huì)危及人體生命健康等。病毒感染會(huì)出現(xiàn)大面積感染的現(xiàn)象，甚至可能會(huì)出現(xiàn)人傳人等可怕現(xiàn)象。每年我國(guó)禽獸養(yǎng)殖場(chǎng)都進(jìn)行動(dòng)物疫病檢測(cè)來(lái)避免動(dòng)物病毒感染。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）、免疫熒光測(cè)定（IFA）和細(xì)胞凝集抑制（HI）等是血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)中常用的一些技術(shù)。這些技術(shù)雖然具有操作簡(jiǎn)單、能夠準(zhǔn)確且快速得到試驗(yàn)結(jié)果、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)及獨(dú)特性，但是它們不能同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)?？梢暬鞍踪|(zhì)芯片技術(shù)既保留了抗原-抗體反應(yīng)的快速性、靈敏性和特異性，又兼?zhèn)淞丝梢暬鞍仔酒夹g(shù)高通量、可同時(shí)檢測(cè)多種樣品、所需樣品量少、檢測(cè)成本低、高平行、微型化和高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，有利于大規(guī)模在食品安全中動(dòng)物疫病檢測(cè)中的推廣與應(yīng)用。

石霖等[30-32]針對(duì)不同特殊抗體之間的特異性，將免疫膠體金技術(shù)與銀顯影技術(shù)相互融合，設(shè)計(jì)出了一種可同時(shí)用于檢測(cè)出常見(jiàn)動(dòng)物疫?。ㄇ萘鞲?，雞新城疫等）兩種或四種血清抗體的可視化蛋白質(zhì)芯片。與瓊脂擴(kuò)散法相比較，可視化蛋白芯片具有更高的靈敏度，靈敏度高達(dá)400倍以上。同時(shí)該芯片又具有高通量，可同時(shí)檢測(cè)出動(dòng)物疫病兩種或四種血清抗體的特點(diǎn)。通過(guò)大面積的動(dòng)物疫病檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，可視化蛋白芯片技術(shù)具有高靈敏度、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確且高效、不需要昂貴的儀器設(shè)備、檢測(cè)僅用肉眼所見(jiàn)或在顯微鏡下觀察、可推廣到基層使用等優(yōu)點(diǎn)，該方法同時(shí)結(jié)合免疫膠體金技術(shù)、銀顯影技術(shù)和蛋白芯片技術(shù)，并且首次將純化的全病毒蛋白作為捕獲抗原，是血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)上的突破與創(chuàng)新。

由此可見(jiàn)，可視化蛋白芯片技術(shù)作為一種新型的生物技術(shù)，雖然在動(dòng)物疫病檢測(cè)的研究并沒(méi)有非常全面，但是可視化蛋白芯片在動(dòng)物疫病檢測(cè)方面將會(huì)有較好的發(fā)展前景。

2 結(jié)語(yǔ)與展望

食品安全問(wèn)題關(guān)系人們的健康安全，在當(dāng)前的時(shí)代背景下，食品安全問(wèn)題備受關(guān)注?？梢暬鞍仔酒夹g(shù)雖然發(fā)展時(shí)間較短，但是憑借其獨(dú)特性在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，如更快速并且準(zhǔn)確地得到檢測(cè)結(jié)果、靈敏度高、通量高、檢測(cè)時(shí)間短、價(jià)格低廉、無(wú)需依靠昂貴的檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)、僅通過(guò)肉眼就可以觀察到檢測(cè)結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)。因此，可視化蛋白芯片技術(shù)有望在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛的推廣應(yīng)用。