五寶膠囊通過(guò)調(diào)節(jié)Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞上下游細(xì)胞因子抑制哮喘模型小鼠氣道炎癥的研究 Δ

張秋實(shí) ，黃豐 ，童曉云 ，楊竹雅 ，李寶晶 ，林玉萍 ，瞿璐 ，聶堅(jiān) ，虎春艷 （.云南中醫(yī)藥大學(xué)南藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研部，昆明 6500；.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，昆明 650500；.云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，昆明 650500）

哮喘是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康的一種氣道慢性炎癥性疾病[1-2]。2019年《柳葉刀》報(bào)道，我國(guó)哮喘患病率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，其中20歲以上人群哮喘患病率為4.2%，涉及人口超過(guò)了4 500萬(wàn)[3]。研究表明，除了獲得性免疫外，固有免疫也被認(rèn)為與哮喘有關(guān)[4]。在固有免疫細(xì)胞中，Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞（type Ⅱ innate lymphoid cells，ILC2s）被認(rèn)為是通過(guò)釋放輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）因子而導(dǎo)致嗜酸性氣道炎癥的關(guān)鍵[5-6]。過(guò)敏原可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素25（interleukin 25，IL-25）、IL-33和胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）。這些細(xì)胞因子可激活I(lǐng)LC2s而產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-9、IL-13等炎癥因子，并引起氣道炎癥[7-10]。

五寶膠囊又名“五寶散”（或“雅叫哈頓散”），為傣醫(yī)傳統(tǒng)解藥名方，自1977年以來(lái)被歷版《中國(guó)藥典》所收載。五寶膠囊由小百部、藤苦參、苦冬瓜、箭根薯、蔓荊子莖葉以及羊耳菊根6味藥等量組成，具有清熱解毒、止血止痛以及調(diào)平“風(fēng)、火、水、土”四塔和“色、識(shí)、受、想、行”五蘊(yùn)的功效，臨床用來(lái)治療寒熱感冒、咽喉腫痛、虛勞心悸、咳嗽咯血、月經(jīng)不調(diào)、氣血不足、產(chǎn)后諸風(fēng)、胸腹脹痛和產(chǎn)后流血不止等癥[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，五寶膠囊能夠改善氣道炎癥，可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2和Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的平衡來(lái)發(fā)揮防治哮喘的作用[12]。本研究進(jìn)一步探索了五寶膠囊對(duì)哮喘模型小鼠氣道炎癥及ILC2s上下游細(xì)胞因子的影響，以期為傣藥五寶膠囊更廣泛的臨床應(yīng)用和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

本研究所用主要儀器包括INQUA NEB plus型超聲霧化儀（德國(guó)PARI公司）、AR224CN型分析天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]、Spectra Max Plus 384型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）、1706型離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）、8920型超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 主要藥品與試劑

五寶膠囊（批號(hào)170703，每粒含生藥量0.2 g）購(gòu)自云南西雙版納藥業(yè)有限公司；卵清蛋白（ovalbumin，OVA；批號(hào)A5253）和地塞米松原料藥（貨號(hào)D1756，純度≥98%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；納米氫氧化鋁（批號(hào)37801）購(gòu)自阿拉丁科技（中國(guó)）有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色液（貨號(hào)G1005）和過(guò)碘酸雪夫（PAS）染色液（貨號(hào)G1008）均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；IL-5、IL-9、IL-13、IL-33、TSLP、免疫球蛋白 E（immunoglobulin E，IgE）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為 A20580821、A20980513、A21381132、A23380314、A26580933、A27581115）均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；IL-25（IL-17E）ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)M201211-007a）購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司；黏蛋白5AC（MUC5AC）ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)ZKVBMELGV3）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；OVA-IgE ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)544983）購(gòu)自美國(guó)Cayman公司；脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonucleaseⅠ ，DNase Ⅰ ；批號(hào) 35027800）和 LiberaseTM（批號(hào)35537400）均購(gòu)自瑞士Roche公司；水為超純水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性6～8周齡的BALB/c健康小鼠40只，體質(zhì)量為18～20 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（遼）2020-0001。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)溫度22～24 ℃，環(huán)境相對(duì)濕度50%～60%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為R-06201910。

2 方法

2.1 試劑的制備

2.1.1 地塞米松藥液 準(zhǔn)確稱取地塞米松粉末3.0 mg，用30 μL乙醇溶解后用生理鹽水定容至30 mL，配制成0.1 mg/mL的溶液，置于4 ℃冰箱保存，使用前用渦旋儀混勻。

2.1.2 五寶膠囊溶液 稱取五寶膠囊粉末5.0 g，加入50 mL的生理鹽水溶解，制備成100 mg/mL的母液，再用生理鹽水稀釋為50 mg/mL的溶液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組、造模和給藥

40只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和五寶膠囊低、高劑量組，每組8只。參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]建立哮喘模型：模型組和給藥組小鼠分別于第1、8、15天腹腔注射0.2 mL含氫氧化鋁的OVA致敏液（OVA 1 mg/mL、氫氧化鋁5 mg/mL、生理鹽水0.2 mL）；正常組小鼠腹腔注射0.2 mL生理鹽水。從實(shí)驗(yàn)第21天開始，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠每天灌胃1 mg/kg地塞米松藥液，五寶膠囊低、高劑量組小鼠每天分別灌胃0.5、1 g/kg五寶膠囊溶液[12]，正常組和模型組小鼠每天灌胃10 mL/kg生理鹽水，連續(xù)7 d。每次灌胃1 h后，將模型組和給藥組小鼠置于霧化器內(nèi)，予2%OVA溶液6 mL霧化激發(fā)，每天1次，每次30 min；正常組小鼠予生理鹽水霧化激發(fā)。

2.3 血清中IgE、OVA-IgE含量的檢測(cè)

最后一次霧化激發(fā)小鼠24 h后，各組小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉（0.01 mL/g）麻醉，剪除小鼠眼睛周圍毛發(fā)后，用75%的乙醇消毒，摘除眼球取血，血液靜置1 h，于4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，取上清液保存于-80 ℃冰箱中待測(cè)。按ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清中的IgE、OVA-IgE含量。

2.4 BALF中相關(guān)細(xì)胞因子和黏蛋白含量的檢測(cè)

各組小鼠取血后，脫頸椎處死，固定于小鼠解剖板上，用75%乙醇消毒小鼠胸腹腔，進(jìn)行氣管內(nèi)插管。右肺用血管夾夾閉，左肺用0.6 mL磷酸鹽緩沖液分2次灌洗，每次沖洗3遍；回收并合并2次支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），于4 ℃下以1 000 r/min離心10 min，取上清液按ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè) BALF 中 IL-5、IL-9、IL-13、IL-25、IL-33、TSLP、MUC5AC的含量。

2.5 肺組織病理變化和杯狀細(xì)胞增生的觀察

收集完小鼠BALF后，取各組小鼠右肺中葉，用磷酸鹽緩沖液沖洗后，濾紙吸干，置于4%多聚甲醛固定液中24 h后，將組織切片并包埋于石蠟中，制備5～8 μm切片。用HE染色并評(píng)估分析小鼠肺組織炎性浸潤(rùn)情況和氣管增厚情況；通過(guò)PAS染色觀察各組小鼠氣道杯狀細(xì)胞的分布。

2.6 肺組織中ILC2s數(shù)量的檢測(cè)

收集完小鼠BALF后，分離除五寶膠囊低劑量組（由于在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)低劑量五寶膠囊沒有藥效，所以本實(shí)驗(yàn)沒有分離五寶膠囊低劑量組）以外各組小鼠右肺上葉及下葉，并研磨成碎片，加入DNase Ⅰ和LiberaseTM，在37 ℃下消化20 min，用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺組織中ILC2s的數(shù)量。流式配色方案為7AAD-CD45+LIN-KLRG 1+ST2+。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 五寶膠囊對(duì)哮喘小鼠血清中IgE、OVA-IgE的影響

如表1所示，與正常組比較，模型組小鼠血清中IgE、OVA-IgE含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，五寶膠囊高、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清中IgE、OVA-IgE含量均顯著降低（P＜0.01）。

表1 各組小鼠血清中IgE、OVA-IgE含量檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝8，pg/mL）

表1 各組小鼠血清中IgE、OVA-IgE含量檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝8，pg/mL）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01

組別正常組模型組陽(yáng)性對(duì)照組五寶膠囊低劑量組五寶膠囊高劑量組OVA-IgE 0.78±0.49 5.91±0.45a 2.08±0.64b 2.79±0.62b 1.55±0.31b IgE 104.77±4.70 177.14±7.17a 114.45±6.26b 142.06±5.82b 129.64±5.46b

3.2 五寶膠囊對(duì)小鼠BALF中ILC2s上游細(xì)胞因子IL-25、IL-33、TSLP的影響

如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠BALF中ILC2s上游細(xì)胞因子IL-25、IL-33、TSLP含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，五寶膠囊高、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠BALF中IL-25、IL-33、TSLP含量均顯著降低（P＜0.01）。

3.3 五寶膠囊對(duì)小鼠BALF中ILC2s下游細(xì)胞因子IL-5、IL-9、IL-13的影響

如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠BALF中ILC2s下游細(xì)胞因子IL-5、IL-9、IL-13含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，五寶膠囊高、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠BALF中IL-5、IL-9、IL-13含量均顯著降低（P＜0.01）。

3.4 五寶膠囊對(duì)小鼠肺組織病理變化的影響

如圖1所示，正常組小鼠的肺組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜上皮完整，氣管平滑肌和基底膜正常，無(wú)明顯增厚現(xiàn)象；模型組小鼠氣管、肺泡以及肺間質(zhì)周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，基底膜增厚嚴(yán)重，上皮增生；與模型組比較，五寶膠囊高、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及基底膜增厚均有不同程度的緩解。

圖1 各組小鼠肺組織的病理學(xué)顯微圖（HE染色，×200）

3.5 五寶膠囊對(duì)小鼠肺組織杯狀細(xì)胞增生的影響

氣道內(nèi)的杯狀細(xì)胞可分泌黏液，黏液中黏蛋白糖原部分可被PAS染為藍(lán)紫色。如圖2所示，正常組小鼠氣道完整，無(wú)杯狀細(xì)胞增生，未見黏液；模型組小鼠氣道見大量藍(lán)紫色，說(shuō)明黏液較多，杯狀細(xì)胞增生明顯；五寶膠囊高、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠氣道內(nèi)藍(lán)紫色均有所減少，可見杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌被抑制。如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠BALF中MUC5AC含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，五寶膠囊高、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠BALF中MUC5AC含量均顯著降低（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠肺組織杯狀細(xì)胞增生顯微圖（PAS染色，×200）

表2 各組小鼠BALF中ILC2s上下游細(xì)胞因子和黏蛋白含量檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝8，pg/mL）

表2 各組小鼠BALF中ILC2s上下游細(xì)胞因子和黏蛋白含量檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝8，pg/mL）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01

組別M U C 5 A C I L-2 5 I L-3 3 T S L P I L-5 I L-9 I L-1 3正常組模型組陽(yáng)性對(duì)照組五寶膠囊低劑量組五寶膠囊高劑量組0.8 1±0.1 4 1.9 2±0.1 4 a 0.9 9±0.0 8 b 1.1 0±0.3 5 b 1.0 4±0.0 9 b 5 3 4.4 9±7 4.3 6 1 6 9 0.3 9±1 1 7.7 8 a 7 9 4.7 1±6 6.4 7 b 1 0 6 0.2 1±1 4 1.3 2 b 9 9 1.1 9±1 3 6.1 7 b 2 8 8.7 4±3 5.6 1 6 9 2.6 4±4 0.3 4 a 3 3 2.8 8±3 6.3 5 b 4 4 9.8 3±2 5.1 2 b 3 7 3.6 8±2 4.7 2 b 2 0 3.5 6±1 3.6 2 3 5 7.9 8±2 4.6 3 a 2 3 0.9 9±9.2 7 b 2 6 8.3 8±1 4.9 3 b 2 4 6.2 8±1 1.6 9 b 7 7.3 8±5.2 2 1 6 4.6 9±9.6 4 a 9 1.9 4±6.9 4 b 1 1 3.7 2±9.1 5 b 8 6.2 3±1 1.8 2 b 6 2 6.7 8±4 7.5 5 1 7 1 3.9 6±6 8.1 1 a 1 0 8 3.3 8±7 2.5 9 b 1 4 2 0.9 3±8 0.2 2 b 1 2 9 5.7 3±5 0.9 9 b 1 2 9.1 0±2 8.5 0 2 9 9.8 3±3 4.3 3 a 1 5 0.2 5±4 0.1 1 b 1 9 3.4 1±4 2.9 6 b 1 6 9.3 5±2 2.1 8 b

3.6 五寶膠囊對(duì)小鼠肺組織中ILC2s數(shù)量的影響

如圖3和圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠肺組織中ILC2s數(shù)量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，五寶膠囊高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肺組織中ILC2s數(shù)量均顯著降低（P＜0.01）。

圖3 各組小鼠肺組織中ILC2s的流式圖

圖4 各組小鼠肺組織中ILC2s數(shù)量的檢測(cè)結(jié)果（n＝8）

4 討論

傣醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“四塔”“五蘊(yùn)”在人體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡是維持人體正常生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。哮喘主要因體內(nèi)四塔、五蘊(yùn)功能失調(diào)，加之冷風(fēng)寒邪、痰濕不化、上犯于肺，阻塞肺氣而發(fā)。其傳統(tǒng)經(jīng)方五寶膠囊具有“調(diào)平四塔、清火解毒”等功效，在臨床上可用于治療咳喘、咳痰[11]。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)該復(fù)方的研究報(bào)道相對(duì)較少。

肺部病理改變是哮喘的表征。在哮喘病理組織切片上可觀察到氣道、肺泡及肺間質(zhì)周圍有大量炎性細(xì)胞、上皮增生、黏蛋白增多、氣道壁增厚、氣道管腔狹窄。而這些病理變化以氣道炎癥為基礎(chǔ)產(chǎn)生，炎癥是哮喘發(fā)病機(jī)制的中心[13]。ILC2s通過(guò)介導(dǎo)2型細(xì)胞因子（包括IL-4、IL-5、IL-9和IL-13）的產(chǎn)生從而激活2型炎癥性疾病（過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性皮炎等）中的嗜酸性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞來(lái)啟動(dòng)和放大氣道炎癥[9]。IL-5可激活嗜酸性粒細(xì)胞，并將其募集到肺部；IL-9可參與肥大細(xì)胞增殖，并在ILC2s存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-10]；IL-13是誘導(dǎo)MUC5AC分泌過(guò)多和導(dǎo)致炎癥的重要因素，IL-13還可通過(guò)介導(dǎo)單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起黏液細(xì)胞化生、氣道纖維化和氣道阻塞[14]。IL-25，也稱為IL-17E，是IL-17細(xì)胞因子家族的成員。IL-17家族的大多數(shù)成員可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，誘發(fā)Th1型炎癥，而IL-25可導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞增多，誘導(dǎo)Th2型炎癥，并引起IL-4、IL-5和IL-13的過(guò)度產(chǎn)生[15-16]。IL-33是IL-1細(xì)胞因子家族的成員，在許多炎癥過(guò)程和疾病中起著至關(guān)重要的作用。IL-33與其受體ST2結(jié)合可增強(qiáng)體外和體內(nèi)Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13的產(chǎn)生[17]。有文獻(xiàn)表明，上皮來(lái)源的IL-33是誘導(dǎo)IL-13產(chǎn)生ILC2s的有效刺激劑[18]。上皮細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子TSLP與哮喘炎癥途徑的啟動(dòng)和持續(xù)有關(guān)，其參與了炎癥性氣道疾病的發(fā)病機(jī)制，包括變應(yīng)性鼻炎、慢性鼻竇炎、哮喘和慢性阻塞性肺病等[19]。哮喘的各種致病因素，包括氣道高反應(yīng)性、黏液過(guò)度產(chǎn)生和氣道重塑，被認(rèn)為至少部分是由TSLP通過(guò)其下游促炎作用驅(qū)動(dòng)的，涉及的細(xì)胞因子包括IL-4、IL-5和IL-13等[20]。因此，ILC2s的積累和激活被認(rèn)為是哮喘炎癥的關(guān)鍵因素[7]。

本研究采用經(jīng)典的哮喘小鼠模型建立方法，選取BALB/c雌性小鼠，多次腹腔注射OVA致敏，霧化吸入OVA后激發(fā)，建立哮喘模型。病理組織切片HE染色顯示，模型組小鼠肺組織氣管周圍炎癥顯著增加，氣道黏液及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多，氣管平滑肌和氣道基底膜增厚，提示哮喘模型建立成功[12，21]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠BALF中的IL-25、IL-33、IL-5、IL-9、IL-13、TSLP含量和肺組織中的ILC2s數(shù)量均顯著升高；經(jīng)五寶膠囊干預(yù)后，上述細(xì)胞因子和ILC2s數(shù)量均不同程度降低，說(shuō)明五寶膠囊可能通過(guò)調(diào)節(jié)ILC2s上下游細(xì)胞因子來(lái)緩解哮喘模型小鼠的炎癥反應(yīng)。

IgE是由B細(xì)胞響應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的過(guò)敏原激活而產(chǎn)生的。過(guò)敏原特異性IgE與免疫效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)的FcεRI受體具有高親和力，二者結(jié)合會(huì)導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞立即激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞脫顆粒及促炎介質(zhì)的釋放[22]。本研究表明，五寶膠囊可以降低哮喘模型小鼠血清中OVA-IgE和IgE的含量，減少炎癥因子的釋放，改善杯狀細(xì)胞增生，減少杯狀細(xì)胞分泌的MUC5AC，從而改善氣道炎癥，進(jìn)而緩解哮喘。

綜上所述，五寶膠囊可通過(guò)調(diào)節(jié)ILC2s上下游細(xì)胞因子改善哮喘模型小鼠的氣道炎癥反應(yīng)和病理變化，減少哮喘模型小鼠黏蛋白分泌和炎癥細(xì)胞對(duì)肺組織的浸潤(rùn)，減輕哮喘模型小鼠的呼吸道損傷。