15種細胞毒性抗腫瘤藥物在我院PIVAS中的環(huán)境殘留檢測及清潔方法 Δ

耿 洲，王 洋，屈昱晨，陳 浩，劉文秀，費 雯，潘 杰 （蘇州大學附屬第二醫(yī)院藥學部，江蘇 蘇州 215006）

細胞毒性抗腫瘤藥物是指能直接殺傷或抑制腫瘤細胞生長或增殖的一類化合物，該類藥物具有致突變、致畸、致癌性，可通過皮膚接觸、吸入等方式進入人體，導致系統(tǒng)或器官組織功能損傷[1]。有研究表明，細胞毒性抗腫瘤藥物可引起接觸者脫發(fā)、生殖損害及黏膜損傷等[2]。Mahmoodi等[3]研究發(fā)現(xiàn)，長期接觸細胞毒性抗腫瘤藥物的醫(yī)護人員的淋巴細胞遺傳學損傷顯著增加。Moretti等[4]研究發(fā)現(xiàn)，盡管完善了防護措施，但細胞毒性抗腫瘤藥物職業(yè)暴露的醫(yī)護人員仍存在較高的遺傳毒性風險。國內(nèi)多中心研究也表明，長期接觸細胞毒性抗腫瘤藥物的醫(yī)護人員存在較高的職業(yè)暴露風險[5-8]。為找到危險來源，采取正確的防護措施和調(diào)配操作，最終降低細胞毒性抗腫瘤藥物對醫(yī)護人員的危害，本研究根據(jù)該類藥物的臨床使用量，采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography quadrupole orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q/Orbitrap-HRMS）技術(shù)測定了靜脈用藥集中調(diào)配中心（pharmacy intravenous admixture service，PIVAS）環(huán)境中吉西他濱、環(huán)磷酰胺、多柔比星等15種細胞毒性抗腫瘤藥物（以下簡稱“15種藥物”）的含量，以探討減少細胞毒性抗腫瘤藥物環(huán)境殘留的措施，旨在為保障醫(yī)護人員的職業(yè)健康提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Q-Exactive Focus-Q/Orbitrap型高分辨質(zhì)譜儀、Thermo Fisher UltiMate 3000型超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），Milli-Q HR型超純水凈化儀（德國Merck公司），G560E型渦旋儀（美國Scientific Industries公司），H1750R型高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），860-5211A型超聲儀（上海聲彥超聲波儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

環(huán)磷酰胺（批號50-18-0，純度98%）、依托泊苷（批號33419-42-0，純度98%）、異環(huán)磷酰胺（批號3778-73-2，純度98%）、表柔比星（批號56390-09-1，純度≥98%）標準品均購自上海麥克林生化科技有限公司；阿糖胞苷（批號69-74-9，純度＞98%）、吉西他濱（批號122111-03-9，純度＞99%）、甲氨蝶呤（批號59-05-2，純度＞99%）、高三尖杉酯堿（批號26833-87-4，純度≥99%）、雷替曲塞（批號112887-68-0，純度≥99%）、多柔比星（批號25316-40-9，純度＞99%）、柔紅霉素（批號23541-50-6，純度＞98%）、吡柔比星（批號MB3763，純度＞98%）、伊達比星（批號57852-57-0，純度＞98%）、多西他賽（批號114977-28-5，純度≥97%）、紫杉醇（批號33069-62-4，純度＞99%）標準品均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒（批號1681706）購自合肥白鯊生物科技有限公司；所有試劑均為色譜純。

1.3 細胞

人皮膚細胞Hacat（批號20201004）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件及GraphPad Prism 7.01軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 方法與結(jié)果

2.1 15種藥物定量分析方法的建立

2.1.1 試驗條件 色譜條件為：以Thermo Hypersil GOLD（2.1 mm×100 mm，3 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～3 min，10%A；3～14 min，10%A→30%A；14～15.5 min，30%A→90%A；15.5～17.5 min，90%A；17.5～18 min，90%A→10%A；18～21 min，10%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件為：采用全掃描和目標離子選擇性掃描模式，以電噴霧離子源進行正負離子掃描；毛細管溫度為320 ℃；鞘氣體積流量為15 psi；輔助氣體積流量為2 psi；正、負離子模式的噴霧電壓分別為3.5、2.5 kV；透鏡電壓為55 kV；探頭加熱器溫度為300 ℃；最大噴射電流為 100 V；碰撞能量梯度為 10、30、50；掃描范圍 m/z 150～2 000；質(zhì)量分辨率為70 000。15種藥物的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 15種藥物的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)

2.1.2 樣品溶液及陰性溶液的制備 分別精密稱取15種藥物標準品各1 mg，溶于甲醇-乙腈-水（1∶1∶2，V/V/V，下同）溶液1 mL中，得15種藥物質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的單一儲備液。分別精密量取上述各單一儲備液50 μL，混合，加入甲醇-乙腈-水溶液250 μL，制得15種藥物質(zhì)量濃度均為50 μg/mL的混合標準溶液（15MIX溶液），經(jīng)0.22 μm有機濾膜濾過，備用。另取甲醇-乙腈-水溶液作為陰性溶液。

2.1.3 專屬性考察 分別取15種藥物標準品1 mg，加甲醇-乙腈-水溶液稀釋，得15種藥物質(zhì)量濃度均為50 ng/mL的單一標準品溶液。分別取上述單一標準品溶液、陰性溶液、15MIX溶液，按“2.1.1”項下試驗條件進樣分析，記錄色譜圖（圖略）。結(jié)果顯示，15種藥物的檢測互不干擾。

2.1.4 標準曲線繪制與定量下限考察 取“2.1.2”項下15MIX溶液，用甲醇-乙腈-水溶液稀釋，制成系列線性工作溶液，按“2.1.1”項下試驗條件進樣分析，記錄峰面積。以各藥物質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、質(zhì)譜響應(yīng)強度（Y）為縱坐標進行線性回歸，并以線性范圍下限作為定量下限。結(jié)果見表2。

表2 阿糖胞苷等15種藥物的回歸方程與線性范圍

2.1.5 準確度與精密度試驗 按“2.1.4”項下線性范圍，每種藥物設(shè)置4個濃度（阿糖胞苷質(zhì)量濃度設(shè)1、3、80、250 ng/mL，吉西他濱、高三尖杉酯堿、異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺均設(shè)0.5、1、15、80 ng/mL，甲氨蝶呤、依托泊苷均設(shè)5、10、150、800 ng/mL，雷替曲塞設(shè)10、30、150、800 ng/mL，多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、吡柔比星、伊達比星、紫杉醇均設(shè) 1、3、150、800 ng/mL，多西他賽設(shè)30、80、250、800 ng/mL），按“2.1.1”項下試驗條件于同一天對每個濃度平行測試5次，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)進樣3 d，每個濃度平行測試5次，考察日間精密度；將實測質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進行比較，以相對誤差（relative error，RE）考察準確度。結(jié)果顯示，15種藥物的日內(nèi)、日間精密度的RSD均不高于20.00%，RE為-14.04%～14.55%，符合《中國藥典》的相關(guān)規(guī)定[9]。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下15MIX溶液，用甲醇-乙腈-水溶液稀釋，得各成分質(zhì)量濃度均為1 000 ng/mL的溶液。取各藥物在線性范圍內(nèi)的溶液，用上述質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL的溶液稀釋，制得低、高質(zhì)量濃度的溶液（阿糖胞苷為3、250 ng/mL，吉西他濱、高三尖杉酯堿、異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺為1、80 ng/mL，甲氨蝶呤、依托泊苷為10、800 ng/mL，雷替曲塞為30、800 ng/mL，多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、吡柔比星、伊達比星、紫杉醇為3、800 ng/mL，多西他賽為80、800 ng/mL），分別于室溫下放置12、24 h時，按“2.1.1”項下試驗條件進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，15種低質(zhì)量濃度藥物的RE在±20%之間；高質(zhì)量濃度中除12 h的雷替曲塞、多柔比星和24 h的吉西他濱外，其余藥物的RE均在±20%之間。

2.2 PIVAS環(huán)境中15種藥物的殘留量檢測

為了檢測PIVAS環(huán)境中藥物的殘留，本課題組首先對采樣方法進行了考察，并通過此采樣方法對PIVAS環(huán)境中15種藥物的殘留量進行檢測。

2.2.1 采樣方法考察 （1）擦拭材料考察。取“2.1.2”項下15MIX溶液，用甲醇-乙腈-水溶液稀釋至各成分質(zhì)量濃度均為1 μg/mL后，取100 μL滴于生物安全柜操作表面，分別用玻璃纖維濾紙、定性濾紙、醫(yī)用紗布和無塵紙進行擦拭，按“2.1.1”項下試驗條件進樣分析，考察不同擦拭材料對藥物回收率的影響。結(jié)果顯示，除阿糖胞苷和吡柔比星外，玻璃纖維濾紙擦拭下其余13種藥物的回收率均在80%～120%之間，故選擇玻璃纖維濾紙作為擦拭材料。結(jié)果見圖1A。

圖1 不同因素對阿糖胞苷等15種藥物回收率的影響

（2）解吸溶液考察。取“2.1.2”項下15MIX溶液，滴于生物安全柜操作面上，待溶液揮干。分別取50 μL20%乙腈、50%乙腈、80%乙腈、甲醇-乙腈-水溶液潤濕玻璃纖維濾紙后，擦拭生物安全柜操作面，然后將上述濾紙置于1.5 mL EP管中，分別加入20%乙腈、50%乙腈、80%乙腈、甲醇-乙腈-水溶液450 μL，渦旋15 min，再超聲10 min，以12 000 r/min離心20 min后，取100 μL，按“2.1.1”項下試驗條件進樣分析，考察不同解吸溶液對藥物回收率的影響。結(jié)果顯示，以50%乙腈和甲醇-乙腈-水溶液為解吸溶液時，15種藥物的回收率均在80%～120%之間。由于甲醇-乙腈-水溶液更加穩(wěn)定，故選擇該溶液為解吸溶液。結(jié)果見圖1B。

2.2.2 PIVAS環(huán)境的檢測 分別于環(huán)境清潔（先用清水清潔，再用500 mg/L含氯消毒劑清潔5 min，最后用75%酒精清潔后風干）前后，將玻璃纖維濾紙用50 μL甲醇-乙腈-水溶液潤濕后擦拭待測區(qū)域（表5中所示區(qū)域），擦拭后將濾紙置于1.5 mL EP管中，加入甲醇-乙腈-水溶液450 μL，按“2.2.1（2）”項下“渦旋15 min……取100 μL”操作，再根據(jù)表2中各藥物的線性范圍（低于定量下限的藥物，需進一步濃縮上清液5倍），按“2.1.1”項下試驗條件進樣分析。結(jié)果顯示，清潔后，共有6種藥物被檢出，其中環(huán)磷酰胺的殘留量較高。結(jié)果見表3。

表3 PIVAS環(huán)境中吉西他濱等6種藥物的檢測結(jié)果（ng/cm2）

2.3 清潔流程優(yōu)化

由表3可知，現(xiàn)有清潔程序并不能完全去除PIVAS環(huán)境中的細胞毒性抗腫瘤藥物殘留，加之目前也未有標準的PIVAS細胞毒性抗腫瘤藥物殘留清潔流程，故本課題組對常用消毒清潔劑的種類、清潔時間、濃度以及清潔程序進行了考察。

2.3.1 常用消毒清潔劑考察 含氯消毒液和苯扎溴銨溶液是PIVAS常用的消毒清潔劑。將生物安全柜操作面分為含氯消毒液區(qū)域和苯扎溴銨區(qū)域。取“2.1.2”項下15MIX溶液200 μL，滴于上述2個區(qū)域，分別用0.1%苯扎溴銨溶液1 mL、500 mg/L含氯消毒液1 mL清潔，將玻璃纖維濾紙用50 μL甲醇-乙腈-水溶液潤濕后，擦拭生物安全柜操作面，擦拭后將濾紙置于1.5 mL EP管中，加入甲醇-乙腈-水溶液450 μL，按“2.2.1（2）”項下“渦旋15 min……取100 μL”操作，再按“2.1.1”項下試驗條件進樣分析。結(jié)果顯示，含氯消毒液區(qū)域除異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺、多西他賽和紫杉醇有殘留外，其余細胞毒性抗腫瘤藥物的殘留量均低于定量下限，表明含氯消毒液對細胞毒性抗腫瘤藥物具有較強的降解作用；苯扎溴銨溶液區(qū)域中均檢出15種藥物殘留，表明苯扎溴銨溶液不具有降解細胞毒性抗腫瘤藥物的作用。結(jié)果見表4。

表4 常用消毒清潔劑條件下阿糖胞苷等15種藥物回收率的檢測結(jié)果（%%）

2.3.2 含氯消毒液消毒時間考察 取4只EP管，每管加入“2.1.2”項下15MIX溶液10 μL，在第1、5、10、15 min分別加入500 mg/L含氯消毒液10 μL，以甲醇-乙腈-水溶液990 μL終止反應(yīng)后，按“2.1.1”項下試驗條件進樣分析。結(jié)果顯示，除阿糖胞苷和吉西他濱外，其余13種藥物在各時間點均降解至定量下限以下；阿糖胞苷和吉西他濱殘留量隨消毒時間的延長而降低，消毒5 min時的殘留量顯著低于消毒1 min時（P＜0.05），但消毒10 min與15 min比較，殘留量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?？紤]實際工作效率，建議含氯消毒液的消毒時間為10 min。結(jié)果見圖2。

圖2 含氯消毒液不同消毒時間下的藥物殘留量結(jié)果

2.3.3 含氯消毒液質(zhì)量濃度考察 取2只EP管，每管加入“2.1.2”項下15MIX溶液10 μL，分別加入500、1 000 mg/L的含氯消毒液10 μL，消毒10 min后，加入甲醇-乙腈-水溶液990 μL終止反應(yīng)后，按“2.1.1”項下試驗條件進樣分析。結(jié)果顯示，在2種質(zhì)量濃度下，除阿糖胞苷和吉西他濱外，其余13種藥物的殘留量均低于定量下限，且1 000 mg/L含氯消毒液時的殘留量低于500 mg/L時，故建議含氯消毒液的質(zhì)量濃度為1 000 mg/L。結(jié)果見圖3。

圖3 含氯消毒液不同濃度下的藥物殘留量結(jié)果

2.3.4 清潔程序考察 清水和75%酒精是常用的細胞毒性抗腫瘤藥物殘留洗滌劑。用水和75%酒精擦拭生物安全柜操作面后，取“2.1.2”項下15MIX 溶液1 mL，均勻涂布于生物安全柜操作面上，待溶劑揮發(fā)后，再用不同清潔程序清潔（程序A：用清水擦拭3次后風干；程序B：用清水擦拭2次+75%酒精清潔1次后風干；程序C：用清水清潔1次+1 000 mg/L含氯消毒液清潔1次+75%酒精清潔1次后風干；程序D：用清水清潔1次+1 000 mg/L含氯消毒液清潔1次+75%酒精清潔1次后，用干紗布擦拭；程序E：用清水清潔1次+0.1%苯扎溴銨溶液清潔1次+75%酒精清潔1次后，用干紗布擦拭），將玻璃纖維濾紙用50 μL甲醇-乙腈-水溶液潤濕后，擦拭生物安全柜操作面，擦拭后將濾紙置于1.5 mL EP管中，加入甲醇-乙腈-水溶液450 μL，按“2.2.1（2）”項下“渦旋15 min……取100 μL”操作，再按“2.1.1”項下試驗條件進樣分析。結(jié)果顯示，A、B程序清潔后共檢出14種藥物，僅雷替曲塞未檢出；C、D、E程序清潔后檢出12種藥物，雷替曲塞、多西他賽、依托泊苷未檢出，同時，D程序清潔后藥物的殘留量較C、E程序清潔后低，故選擇清潔程序為“清水清潔1次+1 000 mg/L含氯消毒液清潔1次+75%酒精清潔1次后，用干紗布擦拭”。結(jié)果見圖4。

圖4 不同清潔程序下的藥物殘留量結(jié)果

2.3.5 酒精揮發(fā)試驗 取“2.1.2”項下15MIX溶液100 μL，用75%酒精400 μL稀釋，制得質(zhì)量濃度為10 μg/mL的溶液作為75%酒精組；另取“2.1.2”項下15 MIX溶液100 μL 2份，加甲醇-乙腈-水溶液400 μL稀釋，制得質(zhì)量濃度為10 μg/mL的溶液，其中1份不作氮吹處理的作為對照組，進行氮吹處理的作為甲醇-乙腈-水溶液組。將75%酒精組和甲醇-乙腈-水溶液組經(jīng)氮吹風干后，以甲醇-乙腈-水溶液500 μL復溶。取上述3組溶液適量，按“2.1.1”項下試驗條件進樣分析。結(jié)果顯示，對照組與75%酒精組各藥物的殘留量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明細胞毒性抗腫瘤藥物不會隨著75%酒精的揮發(fā)而造成操作區(qū)的二次污染；甲醇-乙腈-水溶液組與75%酒精組各藥物的殘留量比較，差異也無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），因此也可排除甲醇-乙腈-水溶液揮發(fā)的影響。結(jié)果見圖5。

圖5 酒精揮發(fā)后各藥物殘留結(jié)果

2.4 細胞毒性抗腫瘤藥物的毒性檢測

有文獻報道，環(huán)磷酰胺經(jīng)光降解后可產(chǎn)生毒性更大的降解產(chǎn)物[10]，因此評價含氯消毒液對細胞毒性抗腫瘤藥物降解作用的同時需考察其安全性。將Hacat細胞接種至96孔板中，不作處理的作為對照組，加入500 mg/L含氯消毒液10 μL的作為CI組，加入15MIX溶液10 μL的作為15MIX組，加入500 mg/L含氯消毒液處理過的15MIX溶液10 μL的作為15MIX+CI組。細胞培養(yǎng)24 h（5%CO2、37 ℃）后，每組加入CCK-8溶液10 μL，溫育3 h，通過酶標儀于450 nm波長處檢測細胞活力。結(jié)果顯示，與對照組比較，15MIX組細胞生存率顯著下降（P＜0.01）；與15MIX組比較，15MIX+CI組的細胞生存率顯著升高（P＜0.01），表明含氯消毒液能降低藥物毒性。結(jié)果見圖6。

圖6 細胞毒性抗腫瘤藥物的毒性檢測結(jié)果

3 討論

與傳統(tǒng)臨床科室配藥相比，PIVAS在配備防護服、口罩、手套等防護工具的前提下，于生物安全柜內(nèi)進行藥物調(diào)配，能顯著降低醫(yī)護人員職業(yè)暴露的風險[11-12]。然而，由于防護能力有限，雖集中調(diào)配藥品，但是細胞毒性抗腫瘤藥物的轉(zhuǎn)運、存儲、配制等環(huán)節(jié)仍然易發(fā)生職業(yè)暴露[13]。醫(yī)護人員與細胞毒性抗腫瘤藥物的頻繁接觸，使得毒性藥物在醫(yī)護人員體內(nèi)蓄積，從而存在白細胞減少、胎兒畸形、流產(chǎn)、致癌等潛在危險[14]。

本研究建立了15種藥物殘留定量采集與檢測的UPLC-Q/Orbitrap-HRMS方法，并評估了方法的準確度與精密度、線性范圍、穩(wěn)定性、回收率等指標，為細胞毒性抗腫瘤藥物殘留的快速評估提供了理論及方法依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，我院PIVAS操作區(qū)域有較高的細胞毒性抗腫瘤藥物殘留量，主要包括吉西他濱、環(huán)磷酰胺及紫杉醇等；雖然采用了嚴格的調(diào)配操作及清潔程序，但仍有不同程度的細胞毒性抗腫瘤藥物殘留，醫(yī)護人員可能會因防護不到位或者重視程度不夠，而引起職業(yè)暴露。

含氯消毒液是PIVAS常用的清潔消毒劑之一，但含氯消毒液的最佳使用濃度、方法及安全性評價未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，與0.1%苯扎溴銨溶液比較，含氯消毒液對細胞毒性抗腫瘤藥物具有明顯的降解作用，以1 000 mg/L含氯消毒液降解作用更強。采用清水、1 000 mg/L含氯消毒液、75%酒精依次擦拭，最后用干紗布擦拭殘留溶劑的清潔程序可顯著降低細胞毒性抗腫瘤藥物的殘留。同時，本研究通過CCK-8實驗也證明，含氯消毒液能顯著降低細胞毒性抗腫瘤藥物的毒性，且殘留藥物不會隨酒精揮發(fā)而造成操作區(qū)域的二次污染。

本研究的局限性為：受研究條件、方法及時間的限制，本研究未對細胞毒性抗腫瘤藥物院內(nèi)物流、沖配操作對環(huán)境的影響等進行評估。筆者將在后續(xù)研究中通過建立統(tǒng)一的細胞毒性抗腫瘤藥物標準化環(huán)境監(jiān)測與管理平臺，輔助藥學部門做好內(nèi)部質(zhì)量控制，減少醫(yī)護人員的職業(yè)暴露風險。