基于氨基酸評(píng)估測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中蛋白質(zhì)水解度

◎ 黃偉乾，霍玟希，盤志琪，練浩宏，許麗珠，黃榮榮，鄭學(xué)殷

（廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司 國(guó)家加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)中心（廣東），廣東 廣州 511447）

蛋白質(zhì)是由不同氨基酸按一定順序通過(guò)肽鍵連接而成的肽構(gòu)成的。氨基酸序列就是蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，它決定著蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和生物功能。蛋白質(zhì)分為完整蛋白和不完整蛋白，蛋白質(zhì)徹底水解的產(chǎn)物為各種氨基酸，部分水解的產(chǎn)物為各種大小不等的肽段和氨基酸。蛋白質(zhì)的常用的水解方式包括酸水解法[1-2]、堿水解法、酶水解法[3]。蛋白質(zhì)水解有利人體營(yíng)養(yǎng)的吸收，通過(guò)蛋白質(zhì)水解，水解為二肽或三肽的產(chǎn)物在人體內(nèi)比自由氨基酸和未水解的蛋白質(zhì)更易于吸收；對(duì)嬰幼兒配方乳粉[4]進(jìn)行適度水解或在配料中添加適量的水解乳清蛋白粉，可降低致敏性，幫助嬰幼兒更好地吸收。特殊醫(yī)學(xué)用配方食品[5-7]中也提到適度水解配方和深度水解配方，對(duì)特殊嬰兒群體具有適用性。

水解蛋白產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)品的影響主要包括以下方面。①營(yíng)養(yǎng)基本不變，水解蛋白的吸收更容易。大部分蛋白質(zhì)需在十二指腸和空腸內(nèi)經(jīng)蛋白水解酶進(jìn)行初步消化，最后是在小腸腸腔內(nèi)消化完成，部分短肽能直接被吸收。②水解蛋白降低嬰幼兒對(duì)乳蛋白的致敏性[8-9]。食物蛋白過(guò)敏是嬰兒對(duì)食物中蛋白質(zhì)不恰當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答引起的不良反應(yīng)。嬰兒早期食物以乳類為主，乳蛋白水解是通過(guò)一定工藝將易引起過(guò)敏反應(yīng)的大分子乳蛋白水解成短肽[10-12]及游離氨基酸。嬰兒食物蛋白過(guò)敏時(shí)通常伴有腹瀉等癥狀，乳蛋白水解減少或消除了食物蛋白的形態(tài)，以減少對(duì)嬰兒胃腸道的刺激。③乳蛋白水解后，乳粉的溶解度更高，水解蛋白的風(fēng)味由原有的乳香味變成氨基酸和肽的特殊風(fēng)味，同時(shí)也增加了氨基酸的鮮味和苦味。

嬰幼兒配方乳粉[13]中蛋白質(zhì)的水解度[14-16]主要來(lái)源有3種。①采用水解工藝進(jìn)行嬰幼兒配方奶粉的生產(chǎn)。②乳中天然的蛋白酶在生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)生酶解作用。③通過(guò)將原料水解、提純后，作為嬰幼兒奶粉生產(chǎn)的原料。

目前報(bào)道的檢測(cè)水解度的主要方法有TNBS法[15]、OPA法、茚三酮比色法、甲醛滴定法[16]等。蛋白質(zhì)的水解度一般是指蛋白質(zhì)被催化水解時(shí)所裂解的肽鍵數(shù)目[14]，占蛋白質(zhì)分子中總肽鍵的比例，但蛋白質(zhì)的肽鍵數(shù)目無(wú)法用常規(guī)方法進(jìn)行計(jì)算或檢測(cè)得出，且蛋白質(zhì)容易存在水解不徹底的情況，以致無(wú)法完全水解成游離氨基酸，導(dǎo)致計(jì)算存在偏差。目前，基于氨基酸進(jìn)行評(píng)估蛋白質(zhì)水解度的報(bào)道較少[14,17]。

高分子蛋白質(zhì)在酸性條件下易被沉淀，相對(duì)分子質(zhì)量較小的的蛋白水解物（如游離氨基酸）可溶于酸性溶液中（如三氯乙酸溶液）。本研究基于采用氨基酸分析/離子交換分離技術(shù)檢測(cè)18種游離氨基酸，再通過(guò)容量法檢測(cè)蛋白氮含量，可計(jì)算出水解度。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

S-433D氨基酸分析儀（Sykam公司），8420自動(dòng)凱氏定氮儀（Foss公司），Milli-Q去離子水發(fā)生器（Millipore公司），MS204T分析天平（梅特勒公司），3-30K高速離心機(jī)（Sigma公司），KDC-1044低速離心機(jī)（中佳公司）。

1.2 材料與試劑

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（16種）、L-半胱氨酸、L-色氨酸均購(gòu)自安譜公司；三氯乙酸、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、磺基水楊酸、鹽酸、檸檬酸鈉和維生素C均為AR級(jí)，廣州化學(xué)試劑廠；茚三酮、鉀鈉緩沖液購(gòu)于Sykam公司；乙腈、三氟乙酸均為色譜純，Thermo fisher公司；去離子水（＞18.0 MΩ·cm），由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白質(zhì)氮含量的測(cè)定

稱取約0.5 g（精確至0.1 mg）樣品，經(jīng)硫酸消解，再經(jīng)自動(dòng)凱氏定氮儀堿性蒸餾，確定蛋白質(zhì)中的氮含量[18]。

1.3.2 氨基酸（18種）氮含量的測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。①L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品12.1 mg，用pH=2.2檸檬酸鹽緩沖液解定容于50.0 mL容量瓶中，配制成2.0 μmol·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃下可保存1個(gè)月。②L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品20.4 mg，用0.05 mol·L-1NaOH溶液定容于50.0 mL容量瓶中，配制成2.0 μmol·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃下可保存1個(gè)月。③混合18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。移取16種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，L-半胱氨酸和L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各250 μL于10 mL容量瓶中，用pH=2.2檸檬酸鹽緩沖液定容，配制成0.025 nmol·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液（現(xiàn)配配用）。

（2）氨基酸分析色譜條件?；撬嵝外c離子分離柱，柱溫：57 ℃，反應(yīng)器溫度：135 ℃，流動(dòng)相流速：0.45 mL·min-1，衍生液流速：0.25 mL·min-1，梯度洗脫見(jiàn)表1。檢測(cè)器波長(zhǎng)：570 nm和440 nm；進(jìn)樣量50 μL，以單點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量。

（3）前處理方法。移取樣品約2 g于100 mL容量瓶中，加約50 mL約50 ℃溫水渦旋振蕩溶解，超聲10 min充分溶解，冷卻后加入5 mL 15%三氯乙酸溶液，加水定容。分取少量樣液于15 000 r·min-1高速離心5 min，取上清液過(guò)0.22 μm尼龍濾膜，待分析。

1.3.3 蛋白水解度的計(jì)算

蛋白水解度按以下公式計(jì)算：

式中：mx為儀器軟件上填寫稱樣量及定容體積即可自動(dòng)算出樣品中各氨基酸質(zhì)量，mg；m為樣品稱樣量，g；N為各種氨基酸的理論含氮量，%；NT為蛋白質(zhì)的氮含量，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸（18種）前處理方式的確定

實(shí)驗(yàn)考察了15%三氯乙酸溶液、3.5%磺基水楊酸、鹽酸調(diào)pH值至4.5（蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)）共3種前處理方式對(duì)色譜分離的影響，分析圖譜（570 nm）見(jiàn)圖1～3。結(jié)果表明：使用磺基水楊酸沉淀處理和三氯乙酸沉淀處理的分離效果較好，干擾較少，且保留時(shí)間較穩(wěn)定，本研究?jī)?yōu)先選擇三氯乙酸前處理。

圖1 三氯乙酸前處理圖

2.2 色譜條件的確定

經(jīng)優(yōu)化，通過(guò)調(diào)整淋洗的梯度，淋洗梯度見(jiàn)表1，18種氨基酸分離較好，標(biāo)準(zhǔn)圖譜見(jiàn)圖4～5。

圖4 18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)圖（570 nm）

表1 梯度洗脫程序表

2.3 氨基酸的回收率、精密度試驗(yàn)

本研究在三氯乙酸沉淀處理下進(jìn)行回收率試驗(yàn)。同時(shí)選取中間添加水平，連續(xù)測(cè)試4次，計(jì)算精密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表2。18種氨基酸在0.05～0.50 μmol·g-1加標(biāo)水平下，回收率在90.8%～108.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=4）為0.8%～3.7%，表明方法具有良好的回收率和精密度，可滿足嬰幼兒配方奶粉中18種游離氨基酸的測(cè)定要求。

表2 18種氨基酸的回收率和精密度測(cè)定結(jié)果表（n=4）

圖2 磺基水楊酸前處理圖

圖3 鹽酸調(diào)pH=4.5前處理圖

圖5 脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)圖（440 nm）

2.4 實(shí)際乳粉樣品蛋白質(zhì)水解度的檢測(cè)

在廣州本地市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買了16份樣品，按本檢測(cè)方案進(jìn)行水解度的檢測(cè)，結(jié)果詳見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，大部分樣品的蛋白質(zhì)水解度較低，經(jīng)核對(duì)配料表發(fā)現(xiàn)少部分樣品添加了氨基酸單體或水解乳清蛋白粉，還發(fā)現(xiàn)標(biāo)識(shí)上標(biāo)注生產(chǎn)過(guò)程中采用了乳蛋白水解工藝進(jìn)行適度處理。嬰幼兒配方乳粉樣品中氨基酸占比越高，則表明蛋白質(zhì)的水解程度越大，水解度就越高。

表3 16份實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表

3 結(jié)論

本文建立了基于18種氨基酸氮含量評(píng)估嬰幼兒配方乳粉中蛋白質(zhì)水解度檢測(cè)方法，方法采用容量法、氨基酸分析法相結(jié)合，測(cè)定水解度的方法學(xué)評(píng)價(jià)表明該方法的回收率和精密度良好。該方法前處理簡(jiǎn)單，可用于嬰幼兒配方乳粉蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定。