堿水解-分光光度法測定食品中的色氨酸含量

◎ 呂浩宇

（譜尼測試集團(tuán)股份有限公司，北京 100080）

L-色氨酸（L-Tryptophan）是人體必需的一種氨基酸[1]，人體每天需要的色氨酸來自內(nèi)源蛋白質(zhì)的分解和食物的消化吸收，這些色氨酸除用于蛋白質(zhì)生物合成外，主要在肝、腎、腦等組織器官發(fā)生代謝[2]。色氨酸會在吲哚胺-2,3-雙加氧酶、單胺氧化酶等作用下，通過色氨酸-5-羥色胺（5-HT）和色氨酸-犬尿氨酸（Kyn）兩條主要途徑降解并排出體外[3]。受機(jī)體飲食以及機(jī)體狀態(tài)的影響，每天攝入的Trp以及參與代謝的酶會發(fā)生變化，這些細(xì)小的變化會造成機(jī)體代謝狀態(tài)的差異，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。嬰幼兒如果缺乏色氨酸，會導(dǎo)致其出現(xiàn)蛋白質(zhì)和脂肪代謝障礙，影響其正常生長發(fā)育。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》（GB 10765—2010）[4]標(biāo)準(zhǔn)中，均規(guī)定嬰幼兒食品中允許添加L-色氨酸，并對含量有明確要求。但我國缺乏各類食品中色氨酸含量的檢測標(biāo)準(zhǔn)，使政府監(jiān)管和企業(yè)質(zhì)量控制難以有效開展。

色氨酸的檢測方法主要有分光光度計(jì)法[5]、離子交換色譜法[6]、液相色譜法[7]和液-質(zhì)聯(lián)用法[8]等，前處理過程一般為堿水解法[9]。本研究建立了一種準(zhǔn)確測定各類食品中包括米面制品、水產(chǎn)品、豆類等色氨酸含量的堿水解-紫外可見分光光度法。該法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，對各類食品的測定結(jié)果滿意，可用于市面上各類產(chǎn)品中色氨酸含量的安全檢測和監(jiān)督抽檢，為色氨酸的監(jiān)管提供了技術(shù)支持，同時(shí)也是對目前色氨酸檢測方法的一種優(yōu)化和補(bǔ)充，并且可以指導(dǎo)人們科學(xué)膳食。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

H1850臺式高速離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；組織搗碎機(jī)：荷蘭皇家飛利浦電子公司；分析天平（感量0.1 mg）：瑞士METTLER TOLEDO公司；ST-04A多功能粉碎機(jī)：上海樹立儀器儀表有限公司；紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；容量瓶；培養(yǎng)箱；比色管；刻度吸管；單刻度吸管。

1.2 試劑與溶液

硫酸溶液（21.2 moL·L-1）；氫氧化鉀溶液（10%）；亞硝酸鈉溶液（0.2%）；對二甲氨基苯甲醛溶液（1%）；L-色氨酸：對照品（純度≥99.0%）；L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg·mL-1）。試劑均為分析純，水為二級水。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 樣品的預(yù)處理

選取具有代表性的樣品，對于水分含量較小的樣品需按四分法縮分至300 g，粉碎并全部通過孔徑為0.25 mm的篩（60目）；對于水分含量較大的樣品需用組織搗碎機(jī)將樣品打成勻漿，過濾，濾液備用。

1.3.2 工作曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取色氨酸（100 μg·mL-1）標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL和0.70 mL（相當(dāng)于20 μg、30 μg、40 μg、50 μg、60 μg和70 μg色氨酸）分別置于10 mL帶塞比色管中，并補(bǔ)加水至1.00 mL，同時(shí)吸取1.00 mL水于10 mL帶塞比色管中作為試劑空白。于各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管及空白管中加入10%氫氧化鉀溶液1.00 mL，混勻，并將標(biāo)準(zhǔn)管與空白管放入裝有冷水的容器中，加入1%對二甲氨基苯甲醛溶液5.00 mL，從裝有冷水的容器中取出所有比色管，搖勻，于室溫放置30 min。向上述各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管及空白管內(nèi)加入0.2%亞硝酸鈉溶液0.20 mL，搖勻，于室溫放置25 min。用1 cm比色杯，以試劑空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于590 nm處測各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，列出回歸方程式。

1.3.3 樣品測定

稱取上述制備好的樣品0.2～1.0 g，精確至0.1 mg。對于脂肪含量＞4%的樣品，稱好樣品后，需將其脫脂后再進(jìn)行后續(xù)操作。將樣品置于50 mL容量瓶中，緩慢加入10%氫氧化鉀溶液25 mL，并輕輕振搖使樣品完全濕潤并且不粘壁，置于（40±2）℃培養(yǎng)箱中水解16～18 h（必須保證16 h，只有水解16 h后，數(shù)據(jù)才穩(wěn)定）。取出水解后的樣品冷卻至室溫后，用水定容到50 mL，搖勻，取部分水解后的樣品溶液以4 500 r·min-1轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液備用，如樣品水解液比較澄清可直接過濾，濾液備用。吸取上清液或?yàn)V液2.00 mL置于樣品比色管中，并將樣品比色管放入裝有冷水的容器中，加入1%對二甲氨基苯甲醛溶液5.00 mL，搖勻。另吸取每個(gè)樣品的上清液2.00 mL于比色管中，加硫酸溶液5.00 mL作為樣品空白，搖勻，于室溫放置30 min。然后于各個(gè)樣品比色管及樣品空白管中加入0.2%亞硝酸鈉溶液0.20 mL，搖勻，于室溫放置25 min。用1 cm比色杯，以試劑空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于590 nm處測定樣品空白（Akb）的吸光度和樣品溶液（A）的吸光度。樣品溶液的吸光度值（A）減去樣品空白的吸光度值（Akb），得到樣品凈吸光度值。

1.3.4 計(jì)算結(jié)果

試樣中色氨酸含量計(jì)算為：

式中：m為試樣質(zhì)量，g；c為從工作曲線上查得色氨酸含量，μg。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

配制上述6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，色氨酸含量分別為20 μg、30 μg、40 μg、50 μg、60 μg和70 μg，并測定此6個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以含量（X，μg）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)作圖可得一直線，經(jīng)最小二乘法計(jì)算，得到線性回歸方程為y=0.007 22x-0.004 6，相關(guān)系數(shù)的R2=0.999 7。在0～70 μg色氨酸含量與吸光度具有良好的相關(guān)性。

2.2 精密度試驗(yàn)

為驗(yàn)證方法的可行性，本試驗(yàn)從市場購買了各類產(chǎn)品，如小米、面粉、雞蛋、大豆、牛肉、蘑菇（干）、魷魚、紫菜、葵花籽和全脂乳粉進(jìn)行驗(yàn)證，產(chǎn)品品類涉及糧食、蛋類、肉類、菌類和海產(chǎn)品等，同時(shí)油脂含量高的首先經(jīng)過脫脂之后再進(jìn)行色氨酸含量的測定，結(jié)果見表1。

表1 各類產(chǎn)品中色氨酸的含量表

由表1可知，各類產(chǎn)品中色氨酸含量測定重復(fù)性好，RSD均＜2.0%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量較高的豆類產(chǎn)品中色氨酸含量相比其他類產(chǎn)品含量較高，色氨酸含量高達(dá)0.471%；其次是魷魚和紫菜，其色氨酸含量分別為0.385%和0.380%，再次是牛肉，色氨酸含量為0.365%，所以為補(bǔ)充色氨酸的攝入量，可以優(yōu)先選擇食用蛋白質(zhì)較高的豆類、海產(chǎn)品和肉類。

2.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密稱取小米、面粉、雞蛋、大豆、牛肉、蘑菇（干）、魷魚、紫菜、葵花籽和全脂乳粉產(chǎn)品，對樣品進(jìn)行不同梯度的加標(biāo)，并按照上述1.3.3的試驗(yàn)操作流程，連續(xù)測定6次，計(jì)算其準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2。

由表2可知，色氨酸在小米、面粉、雞蛋、大豆、牛肉、蘑菇（干）、魷魚、紫菜、葵花籽和全脂乳粉產(chǎn)品中進(jìn)行不同梯度的加標(biāo)后，回收率在93.6%～97.0%，回收效果良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0%，該方法精密度高，準(zhǔn)確度好，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）中回收率范圍和精密度的要求，具有良好的重現(xiàn)性，方法可操作性強(qiáng)，適合于各類產(chǎn)品中色氨酸含量的檢測，可用于市面上各類產(chǎn)品中色氨酸含量的安全檢測和監(jiān)督抽檢，為各類食品中色氨酸含量的監(jiān)管提供了技術(shù)支持。

表2 色氨酸在各類產(chǎn)品中的加標(biāo)回收率表（n=6）

2.4 檢出限和定量限

以試劑空白溶液重復(fù)測20次，按3倍信噪為此光度法檢出限，按10倍信噪為此光度法定量限。通過20次的測定，并以最大取樣量為1.0 g，帶入1.3.4中的公式進(jìn)行計(jì)算，得出檢出限為0.005%，定量限為0.014%。

3 結(jié)論

隨著人們對色氨酸的重視程度越來越高，用于色氨酸檢測的眾多技術(shù)，如前處理方法、光譜法、色譜法等在檢測準(zhǔn)確度、精密度、自動(dòng)化測定方面在不斷革新。但液相色譜法操作復(fù)雜、影響因素多；毛細(xì)管電泳法分辨率及選擇性低；氨基酸自動(dòng)分析儀昂貴、運(yùn)行費(fèi)用高。因此，色氨酸檢測技術(shù)未來的研究趨勢可以將多種檢測技術(shù)融合、取長補(bǔ)短，開發(fā)普遍適用、準(zhǔn)確快捷的測定食品中色氨酸含量的方法。本研究通過堿水解-分光光度法，建立了小米、面粉、雞蛋、大豆、牛肉、蘑菇（干）、魷魚、紫菜、葵花籽和全脂乳粉中色氨酸含量的測定方法。其回收率在93.6%～97.0%，RSD＜5.0%，該方法準(zhǔn)確度好，靈敏度高，適用于各類產(chǎn)品如海產(chǎn)品、糧食、乳粉、堅(jiān)果籽類中色氨酸含量的檢測，為驗(yàn)證方法的可行性，購買了各類產(chǎn)品進(jìn)行驗(yàn)證，將該方法應(yīng)用于實(shí)際各類食品中色氨酸含量的檢測。結(jié)果表明，不同產(chǎn)品的樣品之間，色氨酸的總量差異較大。該方法對于市面上可接觸到的食品進(jìn)行安全性監(jiān)察提供了技術(shù)支持和指導(dǎo)，并且可引導(dǎo)人們合理膳食，既要積極補(bǔ)充色氨酸，也不能過量食用色氨酸含量較高的產(chǎn)品，以免造成肝臟和腎臟的色氨酸代謝紊亂，引發(fā)疾病。