斷血流HPLC特征圖譜的建立及3種成分的含量測定

田京歌，周娟娟，倪 倩，馮有龍

江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210019

斷血流為唇形科植物蔭風(fēng)輪或風(fēng)輪菜的干燥地上部分[1]，具有清熱解毒、涼血、止血、活血等多種功效，在臨床上應(yīng)用廣泛[2-5]，化學(xué)成分主要有黃酮類、皂苷類、揮發(fā)油和其他成分，其中主要的活性成分是黃酮和皂苷類成分，且黃酮類成分含量較高[6-10]，從該藥材中分離得到的黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)類型主要是黃酮和二氫黃酮，包含香蜂草苷、柚皮素、異櫻花素、蒙花苷、芹菜素、金合歡素等17種[6,9,11]，而目前其藥材在《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020版一部斷血流項(xiàng)下無含量測定方法，現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道中多以醉魚草皂苷Ⅳb作為指標(biāo)成分[1,12-15]，比較單一。本文對(duì)斷血流中香蜂草苷、蒙花苷和異櫻花素3種成分的含量進(jìn)行測定，并建立了化學(xué)成分高效液相色譜(high-perfermance liquid chromatography，HPLC)特征圖譜，以期為斷血流的鑒定、開發(fā)利用和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；BS21S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 試藥

芹菜素(批號(hào)111901-201603，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.2%)，醉魚草皂苷Ⅳb對(duì)照品(別名斷血流皂苷A，批號(hào)110782-200602，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%)和蒙花苷(批號(hào)111528-201710，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.6%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；香蜂草苷(批號(hào)J5690010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；異櫻花素(批號(hào)B21567)、金合歡素(批號(hào)B20627)、柚皮素(批號(hào)B21596)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%，均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純均購自美國Fisher公司；水為去離子水(自制)；其他試劑均為分析純。斷血流均購自藥店，產(chǎn)地分別為廣西、湖北和安徽，經(jīng)江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院中藥室胡浩彬主任鑒定為唇形科植物燈籠草[Clinopodiumpolycephalum(Vaniot) C.Y.Wu et Hsuan]和風(fēng)輪菜[Clinopodiumchinense(Benth.) O.Kuntze]的干燥地上部分。見表1。

表1 樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC特征圖譜的建立

2.1.1色譜條件 色譜柱為Agilent 5 TC-C18(2)柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相為甲醇(A)-水(B)。梯度洗脫條件為0～5 min，40% A；5～30 min，40%～50% A；30～35 min，50% A；35～58 min，50%～90% A；58～67 min，90% A。檢測波長為250 nm。流速為1.0 mL·min-1。柱溫為30 ℃。進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2溶液的制備

2.1.2.1供試品溶液的制備 取斷血流粉末(過3號(hào)篩)，精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，置于水浴中加熱回流30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇補(bǔ)足質(zhì)量，揺勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.2對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱定香蜂草苷、柚皮素、蒙花苷、芹菜素、異櫻花素、金合歡素和醉魚草皂苷Ⅳb對(duì)照品，加體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇制成質(zhì)量濃度均約為1 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3方法學(xué)考察

2.1.3.1精密度實(shí)驗(yàn) 取斷血流(S1)，按2.1.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以9號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD(relative standard deviation)值。結(jié)果顯示，相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于3.00%，表明儀器的精密度良好。

2.1.3.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取斷血流(S1)，按2.1.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，以9號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于3.00%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取斷血流(S1)，按2.1.2.1項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以9號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于3.00%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.4特征圖譜建立及相似度評(píng)價(jià) 取斷血流(S1～S10)，分別按2.1.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，將10批斷血流樣品測定數(shù)據(jù)以CDF格式依次導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)，以S1號(hào)樣品色譜圖為參照，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度設(shè)定為0.1 min，多點(diǎn)校正，經(jīng)全譜匹配共確認(rèn)11個(gè)共有峰，10批斷血流的特征圖譜及其共有模式(R)見圖1。將10批樣品與對(duì)照圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，相似度均大于0.85，見表2。表明10批斷血流相似度良好，化學(xué)成分一致性較好。

注：1、2、3、8.未知峰；4.香峰草苷；5.柚皮素；6.蒙花苷；7.芹菜素；9.異櫻花素；10.金合歡素；11.醉魚草皂苷Ⅳb。

表2 10批斷血流相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.1.5色譜峰的指認(rèn)及相對(duì)峰面積計(jì)算 10批斷血流特征圖譜共檢測到11個(gè)共有峰，通過與混合對(duì)照品溶液圖譜中各峰保留時(shí)間及吸收波長進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)出其中的7種成分，分別為4號(hào)峰香蜂草苷、5號(hào)峰柚皮素、6號(hào)峰蒙花苷、7號(hào)峰芹菜素、9號(hào)峰異櫻花素、10號(hào)金合歡素、11號(hào)峰醉魚草皂苷Ⅳb。其中9號(hào)峰峰面積適中、分離完全、穩(wěn)定性較好，選作參考峰，計(jì)算其他共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表3。

2.2 斷血流藥材中3種成分的測定

2.2.1色譜條件 色譜柱為Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相為甲醇(A)-水(B)。梯度洗脫條件為0～5 min，40% A；5～30 min，40%～50% A；30～35 min，50% A；35～58 min，50%～90% A；58～67 min，90% A。檢測波長分別為290 nm(香蜂草苷和異櫻花素)、330 nm(檢測蒙花苷)。流速為1.0 mL·min-1。柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

表3 10批斷血流特征圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2.2溶液的制備

2.2.2.1供試品溶液的制備 取斷血流粉末(過3號(hào)篩)，精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，置于水浴中加熱回流30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇補(bǔ)足質(zhì)量，揺勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取香蜂草苷、蒙花苷、異櫻花素對(duì)照品，加體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇制成質(zhì)量濃度分別為1.510、0.984、1.515 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2.3空白溶液的制備 取體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液作為空白溶液。

2.2.3專屬性實(shí)驗(yàn) 分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶液各10 μL，用高效液相色譜儀測定，色譜圖見圖2。在該色譜條件下空白樣品對(duì)樣品峰無干擾；主峰保留時(shí)間分別約為27、32、48 min，理論板數(shù)按異櫻花素峰計(jì)算大于3 000，說明該方法的專屬性良好。

2.2.4線性實(shí)驗(yàn) 精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別置于10 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液稀釋制成香蜂草苷質(zhì)量濃度分別為15.10、30.20、45.30、60.40、75.50、151.00 μg·mL-1，蒙花苷質(zhì)量濃度分別為9.84、19.69、29.53、39.37、49.22、98.44 μg·mL-1，異櫻花素質(zhì)量濃度分別為15.15、30.30、45.45、60.60、75.75、151.50 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下方法測定3種成分的含量。以質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，香蜂草苷的質(zhì)量濃度在15.10～151.00 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性方程為y1=15.461 1x1+39.704 7，r=0.999 9，峰面積和質(zhì)量濃度均呈良好的線性關(guān)系；蒙花苷的質(zhì)量濃度在9.84～98.44 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性方程為y2=22.097 2x2+39.335 0，r=0.999 8，峰面積和質(zhì)量濃度均呈良好的線性關(guān)系；異櫻花素的質(zhì)量濃度在15.15～151.50 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性方程為y3=35.493 4x3+16.495 6，r=0.999 9，峰面積和質(zhì)量濃度均呈良好的線性關(guān)系。

注：A1、A2.混合對(duì)照品溶液；B1、B2.供試品溶液；C1、C2.空白溶液；1.香蜂草苷；2.蒙花苷；3.異櫻花素。

2.2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液(S1)，重復(fù)檢測6次，并記錄色譜圖。計(jì)算得香蜂草苷峰面積的RSD值為0.75%，蒙花苷峰面積的RSD值為0.60%，異櫻花素峰面積的RSD值為0.71%，表明該方法的系統(tǒng)精密度良好。

2.2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密量取同一批樣品6份，依照2.2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下方法測定，計(jì)算得香蜂草苷的含量為4.670 mg·g-1，含量的RSD值為1.38%；蒙花苷的含量為1.802 mg·g-1，含量的RSD值為1.57%；異櫻花素的含量為2.086 mg·g-1，含量的RSD值為1.35%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將供試品溶液于室溫條件下放置12 h，分別于0、2、4、6、8、10、12 h測定。結(jié)果表明，在室溫條件下放置12 h內(nèi)，測得供試品香蜂草苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.07%，蒙花苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.88%，異櫻花素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.57%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定同一批號(hào)已知香蜂草苷、蒙花苷及異櫻花素3種成分含量的斷血流9份(S1)，每份0.25 g，每3份為1組，按低、中、高分別精密加入一定量的3種成分的對(duì)照品，使對(duì)照品加入量為樣品原有量的50%、100%和150%，按照2.2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下方法測定，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，回收率在97.20%～101.78%范圍內(nèi)，RSD值均小于2.00%，表明該方法的回收率良好。

表4 加樣回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.2.9耐用性實(shí)驗(yàn) 分別測定了在標(biāo)準(zhǔn)色譜條件及不同柱溫(25、35 ℃)、不同流速(0.9、1.1 mL·min-1)、不同流動(dòng)相比例(38∶62～42∶58)、不同品牌色譜柱(安捷倫、菲羅門、沃特世)條件下香峰草苷、蒙花苷和異櫻花素的含量。結(jié)果表明，在柱溫、色譜柱、流動(dòng)相比例及流速等因素有微小變化時(shí)，香峰草苷含量的RSD值為0.74%，蒙花苷含量的RSD值為1.96%，異櫻花素含量的RSD值為0.70%，3種成分含量測定結(jié)果均基本無變化，表明該方法的耐用性良好。

2.2.10樣品含量測定 取不同產(chǎn)地的10批斷血流樣品，按照2.2.1項(xiàng)下方法測定3種成分的含量，結(jié)果見表5。

表5 各成分含量測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 提取方法考察

本研究考察了不同溶劑(甲醇、體積分?jǐn)?shù)50%乙醇、體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇、乙醇)、不同提取方法(超聲提取、水浴回流提取)和不同回流提取時(shí)間(30、60、90 min)對(duì)提取結(jié)果的影響[16]，結(jié)果顯示，將體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇作為溶劑，應(yīng)用水浴加熱回流提取的方法能獲得更高的提取率，具有較低的危害性，且重復(fù)性好。而采用不同的回流提取時(shí)間(30、60、90 min)對(duì)提取結(jié)果的影響不顯著，故將提取時(shí)間定為30 min。

3.2 流動(dòng)相考察

考察了不同流動(dòng)相(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-1 mL·L-1磷酸、乙腈-1 mL·L-1磷酸)[17]對(duì)提取結(jié)果的影響。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相為甲醇-水時(shí)，待測的黃酮類化合物的分離度較好，且與磷酸-水系統(tǒng)相比，其對(duì)色譜柱的損耗小，且簡單易配制，故選用甲醇-水作為流動(dòng)相。

3.3 特征圖譜分析

建立了10批斷血流的特征圖譜，共標(biāo)定了11個(gè)共有峰，通過與對(duì)照品比對(duì)共指認(rèn)出7個(gè)色譜峰，10批樣品相似度在0.856～0.991范圍內(nèi)，說明10批斷血流化學(xué)成分的一致性較好，所建立的特征圖譜可作為斷血流質(zhì)量控制的依據(jù)。通過計(jì)算10批斷血流各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間較穩(wěn)定，說明各批次的各共有峰都能穩(wěn)定出現(xiàn)。但各批次間共有峰的相對(duì)保留峰面積存在一定差異，即各批次間共有峰成分的含量存在一定差異，這可能與產(chǎn)地差異有關(guān)。

斷血流是斷血流制劑的原藥材，是《中國藥典》2020版收載的品種之一，具有清熱解毒、止血、涼血等多種藥理作用。有文獻(xiàn)報(bào)道斷血流乙醇提取物在止血[18]、降糖及內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)[19-20]、抗氧化[21]、抗菌[22]、心臟保護(hù)[23]、活血[6]等方面都有較好的活性。黃酮類化合物可能也是其重要的藥理活性成分之一，對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行深入研究有利于更好地開發(fā)、利用斷血流資源。本研究建立了斷血流的HPLC特征圖譜，可以為藥材的基原鑒定提供參考，同時(shí)測定了香蜂草苷、蒙花苷和異櫻花素3種成分的含量，能夠?yàn)閿嘌鞯馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和更好地開發(fā)、利用斷血流資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。