LncRNA-H9靶向miR-45-5p通過(guò)JAK2/STAT3調(diào)節(jié)大鼠腦血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移

龔翠蘭　楊仁義　傅馨瑩　周德生

〔摘要〕 目的 探討LncRNA-H19靶向miR-145-5p通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)大鼠腦血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell， VSMC）增殖和遷移。方法 培養(yǎng)VSMC，對(duì)照組的細(xì)胞正常培養(yǎng)，TNF-α組的細(xì)胞用100 ng/mL TNF-α處理;將si-NC、si-H19、miR-NC、miR-145-5p mimics轉(zhuǎn)染至TNF-α誘導(dǎo)的VSMC，分別記為TNF-α+si-NC組、TNF-α+si-H19組、TNF-α+miR-NC組、TNF-α+miR-145-5p組;將si-H19和anti-miR-NC、si-H19和anti-miR-145-5p共轉(zhuǎn)染至TNF-α誘導(dǎo)的VSMC，記為TNF-α+si-H19+anti-miR-NC組、TNF-α+si-H19+anti-miR-145-5p組。RT-qPCR法檢測(cè)LncRNA-H19和miR-145-5p表達(dá)水平;MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LncRNA-H19和miR-145-5p的靶向關(guān)系;Western blot法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metallo proteinase 2， MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallo proteinase 9， MMP-9）、磷酸化JAK2（phosphorylated JAK2， p-JAK2）、磷酸化STAT3（phosphorylated STAT3，p-STAT3）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與對(duì)照組比較，LncRNA-H19在TNF-α組中的表達(dá)水平顯著升高，miR-145-5p在TNF-α組中的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。與TNF-α+si-NC組比較，TNF-α+si-H19組H19表達(dá)水平顯著降低，OD值、Cyclin D1、細(xì)胞遷移數(shù)、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低，P21蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。與TNF-α+miR-NC組比較，TNF-α+miR-145-5p組miR-145-5p表達(dá)水平顯著降低，OD值、Cyclin D1、細(xì)胞遷移數(shù)、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低，P21蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。與TNF-α+si-H19+anti-miR-NC組比較，TNF-α+si-H19+anti-miR-145-5p組OD值、Cyclin D1、細(xì)胞遷移數(shù)、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著升高，P21蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與TNF-α+si-NC組比較，TNF-α+si-H19組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;與TNF-α+si-H19+anti-miR-NC組比較，TNF-α+si-H19+anti-miR-145-5p組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。結(jié)論 干擾LncRNA-H19表達(dá)、上調(diào)miR-145-5p表達(dá)可抑制TNF-α組的VSMC增殖和遷移，其與阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路的磷酸化有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 LncRNA-H19;miR-145-5p;JAK2/STAT3信號(hào)通路;TNF-α;血管平滑肌細(xì)胞;增殖;遷移

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.03.005

〔Abstract〕 Objective To investigate the LncRNA-H19 targeting miR-145-5p through JAK2/STAT3 signaling pathway to regulate TNF-α-induced rat cerebral vascular smooth muscle cell （VSMC） proliferation and migration. Methods Culture VSMC， cells in the control group were cultured normally， cells in the TNF-α group were treated with 100 ng/mL TNF-α; si-NC， si-H19， miR-NC， miR-145-5p mimics were transfected into TNF-α-induced VSMC， which were marked as TNF-α+si-NC group， TNF-α+si-H19 group， TNF-α+miR-NC group， TNF-α+miR-145-5p group; si-H19 and anti-miR-NC， si-H19 and anti-miR-145-5p were co-transfected into TNF-α-induced VSMC， and denoted as TNF-α+si-H19+anti-miR-NC group， TNF-α+si-H19+anti-miR-145-5p group. RT-qPCR was used to detect the expression levels of LncRNA-H19 and miR-145-5p; MTT was used to detect cell proliferation; Transwell was used to detect cell migration; luciferase reporter assay was used to detect the targeting relationship between LncRNA-H19 and miR-145-5p; Western blot was used to detect Cyclin D1， p21， matrix metallo proteinase 2 （MMP-2）， matrix metallo proteinase 9 （MMP-9）， phosphorylated JAK2 （p-JAK2）， phosphorylated STAT3 （p-STAT3） protein expression levels. Results Compared with the control group， the expression level of LncRNA-H19 was significantly increased while miR-145-5p was significantly decreased in TNF-α group （P<0.01）. Compared with the TNF-α+si-NC group， the H19 expression level in the TNF-α+si-H19 group was significantly reduced， and the OD value， Cyclin D1， cell migration number， MMP-2 and MMP-9 protein expression levels were significantly reduced， and the P21 protein expression level was significantly increased （P<0.01）. Compared with the TNF-α+miR-NC group， the expression level of miR-145-5p in the TNF-α+miR-145-5p group was significantly decreased， while levels of OD value， Cyclin D1， cell migration number， MMP-2， MMP-9 protein were significantly decreased， and the expression level of P21 protein increased significantly （P<0.01）. Compared with TNF-α+si-H19+anti-miR-NC group， the expression levels of OD value， Cyclin D1， cell migration number， MMP-2， MMP-9 protein were increased significantly in TNF-α+si-H19+anti-miR-145-5p group， and the expression level of P21 protein decreased significantly （P<0.05）. Compared with the TNF-α+si-NC group， the p-JAK2 and p-STAT3 protein expression in the TNF-α+si-H19 group were significantly reduced （P<0.05）; compared with TNF-α+si-H19+anti-miR-NC group， p-JAK2 and p-STAT3 protein expression in TNF-α+si-H19+anti-miR-145-5p group were significantly increased （P<0.05）. Conclusion Interfering the expression of LncRNA-H19 and up-regulating the expression of miR-145-5p can inhibit the VSMC proliferation and migration of TNF-α group， which is related to blocking the phosphorylation of JAK2/STAT3 signaling pathway.

〔Keywords〕 LncRNA-H19; miR-145-5p; JAK2/STAT3 signaling pathway; TNF-α; vascular smooth muscle cell; prolif?eration; migration

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell， VSMC）是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)及維持血管張力的主要細(xì)胞，具有表型重塑的特征，其生物學(xué)行為的改變（如各種原因引起的增殖、凋亡等）可引起高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄等血管重塑性疾病[1-3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA， LncRNA）是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，無(wú)蛋白質(zhì)編碼功能，生物學(xué)性能發(fā)揮作用可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡[4-5]。microRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約19～24 nt的非編碼單鏈RNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶基因的3’-UTR區(qū)部分或完全互補(bǔ)，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，從而起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)的作用[6-7]，其中miRNA-145在VSMCs中特異性高表達(dá)，可特異性抑制kruppel樣因子4（kruppel like factor 4， KLF4），對(duì)VSMCs表型變化及分化具有重要作用[8]，JAK2-STAT3信號(hào)通路是參與細(xì)胞增殖、遷移、代謝、血管再生的重要信號(hào)途徑，多種因子及藥物可通過(guò)激活此通路促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞新生，改善缺血[9-10]。本實(shí)驗(yàn)主要探討LncRNA-H19靶向miR-145-5p通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)大鼠腦VSMC增殖和遷移。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10～12周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠40只，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，合格證號(hào)：4307272011011151067，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（晝夜交替12 h，溫度21～26 ℃，濕度40%～50%），實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20201010-8）。

1.2? 材料、試劑與主要儀器

TNF-α試劑盒（上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：430904）;胎牛血清（批號(hào)：SN201909）、DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：200101）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;四甲基偶氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）試劑盒（上海拜力生物科技有限公司，批號(hào)：PH0533）;RNA提取試劑盒（批號(hào)：SD1412）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：AKA1709）、熒光定量試劑盒（批號(hào)：AK1301）均購(gòu)自TaKaRa Bio公司;MMP-9（批號(hào)：ab48392）、P21（批號(hào)：ab91527）、Cyclin D1（批號(hào)：ab186738）均購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;RIPA蛋白裂解液（批號(hào)：J150003）、二辛可寧酸（bicinchoninic acid， BCA）試劑盒（批號(hào)：GUC0066）均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;Transwell小室（美國(guó)BD公司，批號(hào)：6225968）;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（上海善然生物科技有限公司，批號(hào)：20160831）;Power PacTM Basic基礎(chǔ)電泳儀（電源）（型號(hào)：1645050）、化學(xué)凝膠成像分析儀（型號(hào)：Chemi DocTM XRS+）、熒光定量PCR儀（型號(hào)：CFX96TM）均購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司;臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)（型號(hào)：D3024R，中國(guó)DragonLab公司）。

1.3? 大鼠腦VSMC培養(yǎng)

取3～4只雄性SD大鼠，麻醉后處死，迅速取出整腦，在解剖顯微鏡下分離大腦基底動(dòng)脈，將其反復(fù)剪碎后置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待組織塊與瓶底黏附后將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)平放，繼續(xù)培養(yǎng)3 d可見(jiàn)細(xì)胞爬出，換液后繼續(xù)培養(yǎng)10 d時(shí)觀察到組織塊周圍細(xì)胞相互融合且融合度達(dá)80%左右，進(jìn)行傳代，取培養(yǎng)3代后細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4? 細(xì)胞處理與分組

培養(yǎng)大鼠腦VSMC，對(duì)照組的細(xì)胞正常培養(yǎng)，TNF-α組的細(xì)胞用100 ng/mL TNF-α處理;將si-NC、si-H19、miR-NC、miR-145-5p mimics轉(zhuǎn)染至TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦VSMC，分別記為TNF-α+si-NC組、TNF-α+si-H19組、TNF-α+miR-NC組、TNF-α+miR-145-5p組;將si-H19和anti-miR-NC、si-H19和anti-miR-145-5p共轉(zhuǎn)染至TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦VSMC，記為TNF-α+si-H19+anti-miR-NC組、TNF-α+si-H19+anti-miR-145-5p組。

1.5? RT-qPCR法檢測(cè)LncRNA-H19和miR-145-5p表達(dá)水平

細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，循環(huán)條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán);60 ℃延長(zhǎng)5 min。LncRNA-H19和miR-145-5p分別以GAPDH和U6為內(nèi)參。采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。所需引物序列見(jiàn)表1。

1.6? MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

在各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h時(shí)，每孔分別加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩反應(yīng)10 min使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)OD值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.7? Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

調(diào)整各組細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，Transwell上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含10% FBS培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min。倒置顯微鏡觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，拍照并計(jì)數(shù)。

1.8? Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

根據(jù)蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度后進(jìn)行變性處理，取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE反應(yīng)，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入一抗（稀釋比例MMP-9為1∶1000，P21為1∶3000，Cyclin D1為1∶2000），4 ℃孵育24 h，TBST洗滌，分別加入二抗（山羊抗兔1∶10 000），室溫孵育1 h，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.9? 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LncRNA-H19和miR-145-5p的靶向調(diào)控關(guān)系

采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出LncRNA-H19和miR-145-5p的靶向關(guān)系，含有結(jié)合位點(diǎn)的LncRNA-H19野生型（WT）或突變型（MUT）片段被克隆到pGL3熒光素酶載體中，分別命名為WT-H19或MUT-H19，將WT-H19或MUT-H19與miR-NC或miR-145-5p mimic一起轉(zhuǎn)染，48 h后，使用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

1.10? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以“x±s”表示，各組數(shù)據(jù)若滿足正態(tài)分布和方差齊時(shí)，組間比較采用方差分析，方差不齊則用秩和檢驗(yàn)，同組比較采用成組t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? LncRNA-H19和miR-145-5p在TNF-α誘導(dǎo)VSMC中的表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，LncRNA-H19在TNF-α組中的表達(dá)水平顯著升高，miR-145-5p在TNF-α組中的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。見(jiàn)表2。

2.2? 抑制H19對(duì)TNF-α誘導(dǎo)VSMC中的增殖和遷移相關(guān)蛋白的影響

與TNF-α+si-NC組比較，TNF-α+si-H19組H19表達(dá)水平顯著降低，OD值、Cyclin D1、細(xì)胞遷移數(shù)、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低，P21蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。見(jiàn)圖1、表3。

2.3? 過(guò)表達(dá)miR-145-5p對(duì)TNF-α誘導(dǎo)VSMC中的增殖和遷移的影響

與TNF-α+miR-NC組比較，TNF-α+miR-145-5p組miR-145-5p表達(dá)水平顯著降低，OD值、Cyclin D1、細(xì)胞遷移數(shù)、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低，P21蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。見(jiàn)圖2、表4。

2.4? LncRNA-H19和miR-145-5p的靶向調(diào)控關(guān)系

通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出LncRNA-H19和miR-145-5p的靶向關(guān)系，含有結(jié)合位點(diǎn)的WT或突變型MUT片段被克隆到pGL3熒光素酶載體中，分別稱為WT-H19或MUT-H19，見(jiàn)圖3。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TNF-α+miR-145-5p組與TNF-α+miR-NC組比較，WT-H19熒光素酶活性顯著性增高（P<0.01），MUT-H19熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表5。

2.5? miR-145-5p表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)VSMC增殖和遷移相關(guān)蛋白的影響

與TNF-α+si-H19+anti-miR-NC組比較，TNF-α+si-H19+anti-miR-145-5p組OD值、Cyclin D1、細(xì)胞遷移數(shù)、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著升高，P21蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖4、表6。

2.6? 各組JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

與TNF-α+si-NC組比較，TNF-α+si-H19組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05）;與TNF-α+si-H19+anti-miR-NC組比較，TNF-α+si-H19+anti-miR-145-5p組p-JAK2及p-STAT3蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)圖5、表7。

3 討論

平滑肌即無(wú)紋肌的通稱，是被視為較橫紋肌原始的一種肌肉。平滑肌除作為無(wú)脊椎動(dòng)物的軀體肌而有廣泛分布外，在脊椎動(dòng)物除心肌之外，大部分內(nèi)臟肌也是由平滑肌組成的。對(duì)于正常人，VSMC凋亡調(diào)控著動(dòng)脈血管壁的細(xì)胞數(shù)量和血管穩(wěn)態(tài)，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，VSMC遷移、增殖與細(xì)胞凋亡并存。在臨床上，VSMC的結(jié)構(gòu)一旦有所改變，就會(huì)引發(fā)高血壓等較為嚴(yán)重的病癥出現(xiàn)[11-12]。

LncRNA-H19位于細(xì)胞核內(nèi)或胞質(zhì)中，H19是最早被發(fā)現(xiàn)的有功能的LncRNA之一，它的序列高度保守，可通過(guò)多種模式參與調(diào)控生物學(xué)過(guò)程和疾病的發(fā)生發(fā)展，由于H19最早被證實(shí)在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，加速腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，與腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，因此先前關(guān)于H19的研究大多集中在腫瘤領(lǐng)域。李峰等[13]報(bào)道：在MC3T3-E1細(xì)胞中LncRNA-H19被抑制后，H19表達(dá)量顯著下降并激活miR-185-5p表達(dá)，驗(yàn)證了LncRNA-H19和 miR-185-5p有較強(qiáng)結(jié)合性，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能存在于成骨細(xì)胞的增殖分化過(guò)程中，H19通過(guò)ceRNA機(jī)制發(fā)揮作用，且LncRNA-H19可以有效降低miR-185-5p抑制MC3T3-E1細(xì)胞增殖和分化。

LncRNA-H19在血管重塑中發(fā)揮著重要作用[14]。近年來(lái)已有H19在心腦血管疾病中的研究報(bào)道：Viereck等[15]指出H19基因療法可預(yù)防和逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)性壓力超負(fù)荷引起的心力衰竭，H19充當(dāng)抗心肌肥大的LncRNA代表，LncRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，包括代謝過(guò)程中起著重要作用，H19還可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合let-7a促進(jìn)VSMC增殖，導(dǎo)致血管負(fù)性重塑[16];miR-145是健康大鼠頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)最豐富的miRNA，在VSMC的分化和增殖過(guò)程中扮演著重要角色，其上調(diào)會(huì)促進(jìn)平滑肌細(xì)胞分化，而在細(xì)胞增殖時(shí)表達(dá)下降[17];miR-143/145團(tuán)簇是通過(guò)協(xié)同調(diào)控一個(gè)包括kruppel樣因子5（kruppel like factor 5， KLF5）、KLF4、心肌素的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，建立的調(diào)節(jié)血管平滑肌可塑性的調(diào)節(jié)因子，驅(qū)動(dòng)增殖性VSMC表型變化，從而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞樣特征的發(fā)展和VSMC攝取氧化低密度脂蛋白[18]。MiR-145進(jìn)一步牽涉到促進(jìn)血管平滑肌肌動(dòng)蛋白和鈣橋蛋白等血管平滑肌收縮標(biāo)志物的變化[19]，Lin等[20]發(fā)現(xiàn)LncRNA是通過(guò)直接靶向miR-145調(diào)控VEGF-A的表達(dá)促進(jìn)卵巢癌的腫瘤生長(zhǎng)與血管生成;研究[21]證實(shí)miRNA、hsa-mir-496、hsa-mir-151a、hsa-mir-296-3p、hsa-mir-148a、hsa-mir-365b-5p、hsamiR-3687、hsa-mir-454、hsa-mir-155-5p和hsa-mir-145-5p差異調(diào)節(jié)參與細(xì)胞黏附、血管生成、細(xì)胞周期、JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)的基因、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)、一氧化氮信號(hào)傳導(dǎo)、VEGF信號(hào)傳導(dǎo)和傷口愈合途徑。李文婷等[22]研究指出miR-145靶向MMP-9表達(dá)抑制大鼠腦動(dòng)脈VSMC增殖和遷移;另有研究[23]闡述IL-10通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制VSMC凋亡;顏思陽(yáng)等[24]研究發(fā)現(xiàn)活血榮絡(luò)方可抑制miR-17 miRNA的表達(dá)，上調(diào)STAT3 mRNA的表達(dá)，提示活血榮絡(luò)方可能通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3-miR-17調(diào)控下游相關(guān)通路發(fā)揮作用。

基于以上，筆者推測(cè)LncRNA-H19靶向miR-145-

5p可能通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦VSMC增殖和遷移，故以研究報(bào)道較少的LncRNA-H19和miR-145-5p兩個(gè)指標(biāo)作為切入點(diǎn)進(jìn)行探討，針對(duì)它們之間可能存在的靶向關(guān)系進(jìn)行科學(xué)論證，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制LncRNA-H19和過(guò)表達(dá)miR-145-5p均可導(dǎo)致TNF-α組中增殖和遷移相關(guān)蛋白Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表達(dá)顯著降低，說(shuō)明LncRNA-H19過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞周期的進(jìn)程，它的上調(diào)可顯著促進(jìn)Cyclin D1的表達(dá);熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)經(jīng)常用于RNA結(jié)合靶點(diǎn)的驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)中，與TNF-α+miR-NC組比較，TNF-α+miR-145-5p組WT-H19熒光素酶活性增高，證實(shí)miR-145-5p已被H19靶向和調(diào)節(jié)，上調(diào)LncRNA-H19可以顯著抑制miR-145-5p的表達(dá)，在VSMC中LncRNA-H19與miR-145-5p之間彼此抑制對(duì)方的表達(dá)，存在潛在的相互調(diào)控關(guān)系，故表明LncRNA-H19促進(jìn)VSMC增殖、遷移及細(xì)胞活力的作用受miR-145-5p影響;在抑制miR-145-5p的同時(shí)過(guò)表達(dá)LncRNA-H19可見(jiàn)TNF-α組中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)顯著升高，反向驗(yàn)證了LncRNA-H19靶向miR-145-5p調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠腦VSMC增殖和遷移是通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮作用的，且該過(guò)程可能受細(xì)胞外拮抗劑、膜受體、細(xì)胞質(zhì)微環(huán)境和轉(zhuǎn)錄水平等多個(gè)層次的調(diào)控，但具體機(jī)制尚不明確且缺乏研究報(bào)道。

綜上所述，干擾LncRNA-H19表達(dá)、上調(diào)miR-145-5p表達(dá)可抑制TNF-α誘導(dǎo)大鼠腦VSMC增殖和遷移，其作用機(jī)制可能與阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路的磷酸化有關(guān)，具體作用靶點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制有待更深入的探討，或可為相關(guān)疾病的診治與研究提供新指標(biāo)和新思路。

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