基于RNA-Seq探討玉竹多糖對D-半乳糖誘導衰老小鼠的保護作用

何超平　彭莎　陳博威　李力松　廖端芳

〔摘要〕 目的 探討玉竹多糖對D-半乳糖誘導衰老小鼠認知功能保護作用的分子機制。方法 采用水提醇沉法提取玉竹總多糖組分并進行含量測定;將30只昆明小鼠隨機分為正常組、模型組、玉竹多糖組（2 g/kg）。模型組及玉竹多糖組小鼠每日皮下注射D-半乳糖（150 mg/kg），正常組及模型組每日灌胃等體積生理鹽水，同時玉竹多糖組小鼠灌胃等體積相應劑量的藥物。給藥8周后處死老鼠并收集海馬組織，使用RNA測序（RNA-Seq）分析各組間差異表達的mRNAs，篩選玉竹多糖干預后表達逆轉的mRNAs。通過基因本體分析及京都基因與基因組百科全書通路富集分析差異基因參與的主要生物學過程，實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR， RT-qPCR）驗證測序結果。結果 玉竹多糖提取率為7.12%，含量為81.27%±0.02%。RNA-Seq分析顯示玉竹多糖逆轉了衰老小鼠海馬組織19個mRNAs的表達，生物信息學分析顯示這些基因可能通過各類代謝、血管內皮生長因子信號通路及過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路發(fā)揮治療作用，RT-qPCR驗證了RNA-Seq結果中差異基因的準確性。結論 玉竹多糖可通過多條信號通路來保護D-半乳糖誘導的衰老小鼠的認知功能。

〔關鍵詞〕 玉竹多糖;衰老;RNA-Seq;認知障礙;D-半乳糖

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.03.004

〔Abstract〕 Objective To explore the molecular mechanism of Polygonatum odoratum polysaccharide on the cognitive function of D-galactose-induced aging mice. Methods The total polysaccharides of Polygonatum odoratum were extracted by water alcohol precipitation method and the content was determined. 30 KM mice were randomly divided into normal group， model group， and Polygonatum odoratum polysaccharide group. （2 g/kg）. Mice in the model group and Polygonatum odoratum polysaccharide group were injected subcutaneously with D-galactose （150 mg/kg） daily. At the same time， the normal group and model group were gavaged with equal volume of normal saline daily， and mice in the Polygonatum odoratum polysaccharide group were gavaged with equal volume of corresponding dose. After 8 weeks of administration， the mice were sacrificed and hippocampal tissues were collected. RNA sequencing （RNA-Seq） was used to analyze the differentially expressed mRNAs between the groups， and the mRNAs whose expression was reversed after the intervention of Polygonatum odoratum polysaccharide were screened. Through GO function and KEGG pathway enrichment analysis of the main biological processes involved in differential genes， the sequencing results real-time quantitative PCR （RT-qPCR）. Results The extraction rate of Polygonatum odoratum polysaccharide was 7.12%， and the content was 81.27%±0.02%， RNA-Seq analysis showed that Polygonatum odoratum polysaccharide reversed the expression of 19 mRNAs in the hippocampus of aging mice. Bioinformatics analysis showed that these genes may play a therapeutic role through various metabolism， vascular endothelial growth factor signaling pathway and PPAR signaling pathway. RT-qPCR verified the accuracy of RNA-Seq results. Conclusion Polygonatum odoratum polysaccharide may protect the cognitive function of D-galactose-induced aging mice through multiple signaling pathways.

〔Keywords〕 Polygonatum odoratum polysaccharid; aging; RNA-Seq; cognitive impairment; D-galactose

隨著人口老齡化的不斷加劇，衰老相關疾病發(fā)病率也逐漸增高[1]。衰老是機體各組織、器官功能隨年齡增長而發(fā)生的退行性變化，其中神經退行性病變是指由于神經元進行性變性死亡導致的以大腦為主的中樞神經系統損害的神經系統疾病[2]。與年齡相關的大腦退行性病變是大腦中樞神經系統在生長、發(fā)育及成熟之后走向衰老過程中而表現的生物老化的生理現象，其最突出的臨床表現是記憶和學習能力下降[3]。目前，如何延緩衰老、改善衰老導致的認知障礙已成為研究熱點之一。

玉竹是湖南省道地藥材，具有調免疫、降血糖、抗衰老等廣泛藥理活性[4]，可治療多種疾病，其主要有效成分為玉竹多糖。課題組前期研究已經用行為學結果證實了玉竹多糖改善小鼠認知記憶能力的作用效果，發(fā)現玉竹多糖能夠抑制D-半乳糖誘導的氧化應激，并降低海馬組織中的炎癥因子[5]。但既往研究均是基于單一通路或單一靶點，無法系統闡明玉竹多糖改善衰老后認知功能障礙的分子機制。

本實驗擬借助RNA-Seq技術，采用D-半乳糖作為致衰劑，建立小鼠亞急性衰老模型，以系統探討玉竹多糖在生物體內抗衰老及改善認知障礙的分子機制。

1 材料與方法

1.1? 藥材來源

玉竹來源于湖南省邵東縣國家級玉竹規(guī)范化種植基地，所有用于實驗的玉竹均經湖南中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定為百合科玉竹Polygonatum odoratum （Mill.） Druce。

1.2? 玉竹多糖的提取與測定

1.2.1? 玉竹多糖的提取? 取上述玉竹干燥根莖大約1000 g，置70 ℃烘箱中干燥12 h，用粉碎機粉碎，得藥材粗粉。加8倍量水，于80 ℃水浴中回流提取2次，每次2 h，趁熱過濾，合并2次提取的濾液，并減壓濃縮至約20 mL，加4倍量80%乙醇沉淀，離心（r=20 cm，4000 r/min，10 min），沉淀物以無水乙醇、丙酮依次洗滌3次，每次5 mL，合并濾液，得到玉竹總多糖組分，以60 ℃烘干，稱質量，計算玉竹總多糖得率，備用。

1.2.2? 玉竹多糖脫色、去蛋白? 脫色處理：精密稱取玉竹總多糖1 g，加適量蒸餾水溶解，定容至50 mL容量瓶中，分別緩慢上AB-8大孔樹脂柱，用蒸餾水洗脫，流速1.0 mL/min。取少量洗脫液用Molish反應檢測至無紫色環(huán)出現或紫色環(huán)顏色明顯變淡，停止洗脫。收集洗脫液，減壓濃縮至200 mL，備用。

木瓜蛋白酶-Sevag法去蛋白：取脫色處理后的玉竹粗多糖洗脫液200 mL，加入0.5%體積的木瓜蛋白酶，攪拌，60 ℃水浴酶解2 h，80 ℃滅酶10 min，放冷，離心20 min，r=20 cm，4000 r/min，棄去沉淀取上清液。將上清液與Sevag試劑（氯仿-正丁醇為4∶1）按4∶1的比例混合振蕩20 min，置分液漏斗中靜置分層，取上清液，再重復上述操作3次，留上清液測定玉竹多糖濃度。

1.2.3? 玉竹多糖含量測定? 繪制標準曲線：精密稱取無水葡萄糖標準品20.0 mg，加水溶解，并定容于100 mL容量瓶，搖勻，即得濃度為0.200 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。精密吸取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。分別吸取上述不同濃度的對照品溶液，以試劑做空白對照，在490 nm處測定對照品吸光度值，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。按標準曲線項下方法測定樣品中玉竹總多糖吸光度，計算玉竹多糖含量。

1.3  主要儀器

Illumina測序平臺（美國Illumina公司）;9700型PCR儀（美國ABI公司）;5418型離心機（德國Eppendorf公司）。

1.4? 動物與分組

昆明小鼠30只，雄性，體質量約18～22 g，購于湖南斯萊克景達動物有限公司，動物合格證SCKX（2016-0002），自由飲水飲食。課題組前期研究表明玉竹多糖以每天2 g/kg干預療效確切[5]，因此，本研究采用該劑量進行干預。將動物隨機分為3組，每組10只，分別為正常組、模型組及玉竹多糖組，玉竹多糖組及模型組動物分別每天皮下注射D-半乳糖（150 mg/kg）[8]，正常組用等量生理鹽水代替。同時，玉竹多糖組每天灌胃玉竹多糖，劑量為2 g/kg，正常組與模型組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)給藥8周。

1.5? 海馬組織取材

小鼠脫頸椎處死后，剪開小鼠的頭皮，暴露出頭部，用直鑷將大腦皮層撥開，暴露出雙側海馬組織，將海馬組織與大腦皮層及周圍的腦組織分開，取出海馬組織，置于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.6? RNA-Seq檢測

小鼠麻醉后直接斷頭取腦，冰上操作迅速分離海馬組織，放入預先盛滿RNA wait液的凍存管中，放入液氮中速凍后按照寄送流程，送至上海派森諾公司進行RNA-Seq檢測。采用Trizol法提取總RNA，RNA濃度及質量經檢測合格后，進行mRNA純化、片段化及cDNA合成，建立文庫后上機測序。

1.7? 基因本體（gene ontology， GO）分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and

genomes， KEGG）通路富集分析

借助歐易生物云平臺富集分析模塊（https：//cloud.oebiotech.cn/task/），輸入差異表達的基因，物種選擇為小鼠，進行GO功能及KEGG通路富集分析。GO功能富集分析可描述基因產物可能形式的分子功能、參與的生物過程和所處的細胞環(huán)境。KEGG通路富集分析通過將已知的基因組注釋信息進行分類，得出最顯著的生物學過程。

1.8? 實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR， RT-qPCR）驗證

將RNA-Seq檢測后的剩余樣本進行RT-qPCR驗證。隨機選取了5個差異表達的核心mRNAs。實驗過程嚴格參照試劑盒步驟。海馬組織總RNA的提取采用Trizol法提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性后逆轉錄成cDNA，PCR反應程序：預變性95 ℃，30 s;變性94 ℃，5 s;退火60 ℃，40個循環(huán)。溶解曲線反應程序：從60 ℃緩慢升溫至97 ℃（20 min）。內參基因選用β-actin，使用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量，各引物序列詳見表1。

1.9? 統計學分析

采用差異倍數（fold change， FC）≥1.0及P<0.05篩選差異基因。計量資料均以“x±s”進行統計，采用單因素方差分析的統計學方法來比較多組間均數，P<0.05說明差異有統計學意義。運用Graphpad Prism 8作圖軟件分析并處理。

2 結果

2.1 玉竹多糖含量測定

2.1.1多糖提取率測定 1000 g玉竹根莖按照物料比1﹕5 g/mL，提取時間2 h回流2次，提取溫度80 ℃條件下煎煮濃縮醇沉去蛋白，共提取玉竹多糖71.21 g，玉竹多糖提取率為7.12%。

2.1.2? 多糖含量測定? （1）標準曲線的繪制：使用苯酚-硫酸法，以無水葡萄糖為對照品，在490 nm波長處測定對照品質量濃度與吸光度的對應關系，制備標準曲線，得y=0.474 8x-0.010 4，R2=0.999 8，線性范圍為61.80～100.84 μg/mL。（2）多糖含量測定：按照苯酚-硫酸法測得玉竹多糖含量，根據葡萄糖標準曲線，得到線性回歸方程y=0.474 8x-0.010 4，R2=0.999 8，根據公式得到多糖含量為：81.27%±0.02%。

2.2? 差異mRNAs的篩選

通過RNA-Seq檢測，發(fā)現衰老小鼠海馬組織在衰老后有152個差異表達的mRNAs，其中130個上調，22個下調;另外經玉竹多糖干預后，衰老小鼠海馬組織有70個差異表達的mRNAs，其中30個上調、40個下調，詳見圖1A及圖1B。通過對兩次比較中的差異基因進行交集分析表明，玉竹多糖能夠逆轉在衰老后表達失調的19個mRNAs的表達水平，其中9個mRNAs在衰老后表達上調，經玉竹多糖干預后表達下降;10個mRNAs在衰老后表達下調，經玉竹多糖干預后表達上升，詳見圖1C及圖1D。推測這19個mRNAs可能是玉竹多糖的核心作用靶點。見表2。

2.3? 核心差異mRNA的富集分析

發(fā)現mRNAs GO功能的生物過程主要為神經遞質運輸、蛋白水解及對細胞因子的反應等;細胞組成主要為質膜的組成部分、突觸小泡與軸突等;分子功能主要為金屬羧肽酶活性、轉運活性與膽堿跨膜轉運蛋白活性等，詳見圖2A。KEGG通路富集分析結果主要為各類代謝、VEGF信號通路及PPAR信號通路等，詳見圖2B。

2.4? 核心差異mRNA的RT-qPCR驗證

通過RT-qPCR驗證測序結果，發(fā)現H2-B1及Cbp1在模型組中表達下調，玉竹多糖能夠逆轉其表達趨勢（P<0.01或P<0.05）;Aldh1a2、Sphk1及Slc22a2在模型組中表達上調，玉竹多糖干預后與模型組比較能夠下調其表達（P<0.01或P<0.05），結果均與測序結果趨勢一致，證明其結果具有一定的可靠性，詳見圖3。

3 討論

腦部的衰老會引起大腦的解剖生理變化，而這些變化會影響到認知功能，尤其是處理速度、工作記憶以及行為的執(zhí)行功能[8]。腦衰老的病因和發(fā)病機制復雜，假說主要有Aβ學說、膽堿能學說、氧化應激脂代謝異常學說、神經炎癥學說和神經凋亡學說等[6-9]，因此，衰老是一個復雜的過程，針對這一復雜過程，中藥多成分、多靶點的特點就體現出了獨到的優(yōu)勢。

玉竹為滋養(yǎng)肺陰常用中藥，具有多種藥理學活性，多糖是其有效成分之一，現代藥理研究認為玉竹多糖具有免疫調節(jié)、降低血糖、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤等廣泛的藥理活性[4]。目前，針對玉竹多糖治療腦衰老的研究尚未深入，雖然本課題組前期研究已經證實了玉竹多糖可以改善衰老小鼠的認知功能障礙[5]，但是對于玉竹多糖抗腦衰老還需要進一步系統性研究。

中草藥藥效物質基礎極其復雜，僅依靠傳統研究方法無法系統闡明中藥基于“整體觀念”治療的分子機制。目前，基于高通量測序的檢測手段能夠從整個轉錄組水平探討藥物的治療機制，并已逐漸用于篩選中醫(yī)證候特異性標志物及中藥治療機制研究[10-11]。本研究發(fā)現衰老小鼠海馬組織有152個差異表達的mRNAs，玉竹多糖逆轉了衰老小鼠海馬組織中19個mRNAs的表達，相關文獻亦證實了相關mRNA的作用：如有學者發(fā)現Sphk1在衰老小鼠的海馬組織中表達上調，抑制Sphk1的表達可以改善小鼠認知功能障礙，并抑制炎癥反應[12]。

通過GO功能富集分析與KEGG通路富集，發(fā)現神經遞質運輸、蛋白水解、突觸小泡、金屬羧肽酶活性及轉運活性等生物過程，VEGF信號通路及PPAR號通路等可能與玉竹多糖的抗衰老的機制密切相關。VEGF是一種細胞有絲分裂原，參與了血管生成的生理和病理過程，具有促進血管生長和滲透調節(jié)等作用[13]。最近的研究表明，在神經系統中，VEGF也有保護神經的作用，其對神經生長、營養(yǎng)神經、軸突的生成等方面也有直接作用。PPAR信號通路與認知功能障礙的氧化應激密切相關。氧化應激是指由于氧自由基的產生與清除出現異常致使活性氧蓄積在細胞內，進而誘發(fā)機體氧化損傷的過程。機體正常生命活動中，氧化應激是基本的調控保護機制，可以調控細胞生長增殖、組織再生修復、炎癥免疫應答等過程[14-17]。當機體在經歷衰老和老化時，受氧化應激影響，反應性活性氧簇和反應性活性氮簇產生過多，氧化系統和抗氧化系統就會失衡，活性物質應激性反應導致組織損傷。研究發(fā)現，異常的氧化應激能引起細胞或組織的蛋白變性、脂質過氧化、DNA損傷和其他生理功能改變，導致細胞凋亡和組織損傷，是衰老等神經退行性疾病的主要危險因素[18-19]。前期研究結果表明，衰老的模型小鼠海馬勻漿中超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力均顯著降低，MDA含量顯著升高[20]，用玉竹多糖干預后，有明顯的改善，提示玉竹多糖可以提高細胞抗氧化的能力，達到延緩衰老和抑制氧化損傷的作用[5]。上述報道表明，玉竹多糖能夠通過多靶點改善衰老后的認知功能障礙，也進一步驗證了本研究的準確性。

綜上所述，玉竹多糖能夠通過海馬組織影響

mRNA表達譜，調控VEGF信號通路及PPAR信號通路，改善衰老后認知功能障礙。本研究為進一步明確玉竹多糖抗衰老的分子機制提供了方向。

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