循環(huán)腫瘤細胞檢測與肝癌肝移植

滕大洪，鄭虹（天津市第一中心醫(yī)院器官移植科，天津 300192）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是發(fā)病率第6 位和病死率第4 位的惡性腫瘤［1］。早期HCC通過手術切除或肝移植可獲得治愈，但腫瘤負荷大、血管侵犯或轉(zhuǎn)移者預后較差。在符合米蘭標準的HCC 肝移植3 年復發(fā)率也約20%［2］。用于早期發(fā)現(xiàn)及預后判斷和監(jiān)測治療反應的HCC 生物標志物仍是臨床重要研究方向。

近年來，“液體活檢”技術通過收集體液樣本獲得有關腫瘤的重要表型、遺傳和轉(zhuǎn)錄組信息，顯示出作為HCC 生物標志物的重要前景。液體活檢的主要形式包括循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、microRNA 和細胞外囊泡。不同于常見腫瘤標志物，CTC 技術可獲得有生物活性的腫瘤細胞樣本。CTC 下游分析可識別靶基因中的特定突變，預測治療反應或抗性，幫助指導治療計劃。

本文將介紹CTC 當前技術，以及探索在肝移植治療中其作為HCC 潛在診斷和預后生物標志物的作用。

1 CTC 生物學和臨床意義概述

在增殖浸潤過程中，腫瘤細胞通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶破壞組織基底膜，進入附近血管或淋巴管。入血腫瘤細胞就成為CTC，可通過循環(huán)到達身體的不同組織。大多數(shù)CTC 會因失巢凋亡、免疫攻擊或剪切應力等作用而死亡［3］。CTC 通過失去上皮型表面標志并獲得間質(zhì)標志即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialto-mesenchymal transition，EMT）過程，顯著提高生存和轉(zhuǎn)移能力。此外，CTC 可與成纖維細胞、白細胞、內(nèi)皮細胞或血小板形成聚集體，形成CTC 簇。與單個CTC 相比，CTC 簇具有更高轉(zhuǎn)移潛能和生存能力［4］。CTC 并非相同克隆，而是具有不同腫瘤病灶特征的異質(zhì)細胞群，具有在選擇性微環(huán)境和治療壓力下改變表型和分子特征的能力［5］，原發(fā)性腫瘤內(nèi)的腫瘤細胞與轉(zhuǎn)移部位腫瘤細胞之間存在顯著異質(zhì)性。因此，CTC 檢測不應視為侵入性較小的活檢替代方法，而是一種全面了解全身異質(zhì)腫瘤細胞狀態(tài)的方法。通過CTC 揭示腫瘤分子特征、識別靶向治療標志物，是實現(xiàn)精準醫(yī)療的可能途徑。

液體活檢的另一個重點是游離DNA（cell-free DNA，cfDNA），來源于垂死的腫瘤細胞或吞噬了腫瘤細胞的巨噬細胞［6］。由于ctDNA 包含與其起源腫瘤細胞相同的基因突變，ctDNA 可用于識別異質(zhì)腫瘤特異性突變和表觀遺傳變化，并監(jiān)測正在接受治療患者的腫瘤動態(tài)。ctDNA 已被用于治療反應監(jiān)測或復發(fā)早期檢測［7］。其臨床應用面臨問題之一是其他組織大量cfDNA 背景下如何精確識別ctDNA。此外，ctDNA 能否代表活躍增殖和轉(zhuǎn)移腫瘤細胞基因也是疑問，因為ctDNA 可能不成比例地代表更易死亡的“較弱”腫瘤細胞的DNA［8］。與ctDNA 相比，CTC 的主要優(yōu)勢在于可以捕獲完整、有活力的腫瘤細胞。只要保留其細胞完整性，捕獲的CTC 就可用于功能測定并進行培養(yǎng)以評估耐藥性［9］。

2 CTC 檢測與分離

CTC 的檢測和分離可以分為3 類：基于免疫親和的富集、基于生物物理特性的富集和無富集檢測方法。

免疫親和性檢測方法：基于免疫親和的CTC 富集技術使用針對CTC 細胞表面標志物的抗體。正富集是指通過使用針對特定腫瘤相關抗原的抗體來捕獲CTC，而負富集是指通過使用針對CD45 的抗體來消耗背景中的造血細胞［10］。

CellSearch 系統(tǒng)使用涂有抗EpCAM 抗體的免疫磁珠分離系統(tǒng)［11］。微流控裝置如CTC 芯片由涂有抗體的微柱組成，通過特殊幾何排列以優(yōu)化細胞［12］。CTC-iChip 結(jié)合了微流體和免疫磁技術，檢測的靈敏度更高［13］。NanoVelcro 使用帶有集成微流體混沌混合器的抗體涂層納米結(jié)構基底，通過CTC 與基底接觸以增強CTC 捕獲［14］。

具有EMT 表型的CTC 表面EpCAM 等上皮標志物通常會下調(diào)或丟失［15］，可以逃避傳統(tǒng)陽性富集系統(tǒng)。因此針對干細胞標志物如CD133、間充質(zhì)標志物如vimentin 和癌癥特異性抗原HER2、PSMA 的陽性富集策略也已經(jīng)開發(fā)出來［16］。

但即使是針對多種抗原的混合抗體也可能無法涵蓋CTC 抗原的異質(zhì)性。負富集通過靶向和去除背景造血細胞來解決此問題。通過用抗CD45 代替抗EpCAM，可以使用磁性激活細胞分選（magneticactivated cell sorting，MACS）和CTC-iChip 等技術進行負富集［10］。單獨陰性富集的缺陷是其純度偏低［17］。

生物物理性質(zhì)檢測方法：CTC 的細胞大小、機械可塑性和介電遷移特性與血細胞有顯著差異，能夠使用諸如膜過濾、密度梯度分層、慣性聚焦和介電遷移率等技術將它們分離。這些“無標記”方法不必考慮腫瘤特定抗原的要求，分離的CTC 沒有標記抗體，也使下游試驗更易開展［10］。

ISET［18］和ScreenCell［19］使用軌跡蝕刻膜，而CellSieve［20］使用光刻技術，構建使CTC 損傷最小化的膜結(jié)構。Cluster-Chip 是一種獨特的3D 微過濾系統(tǒng)，專門設計用于捕獲CTC 簇［21］。微濾系統(tǒng)的主要優(yōu)點是能夠快速處理血液以富集CTC。然而，微濾系統(tǒng)易堵塞，且有時白細胞和CTC 之間尺寸重疊，使得結(jié)果準確度存在不足［10］。

密度梯度離心利用比重差異將白細胞和CTC 進行分離。OncoQuick 將離心和過濾相結(jié)合，CTC 捕獲率較高［22］。RosetteSep CTC 使用針對廣泛抗原混合物的抗體復合物將免疫親和性與密度離心相結(jié)合［23］。由于技術可靠、成本低廉，離心被廣泛用于CTC 的初始分離步驟，并與其他策略聯(lián)合。

慣性聚焦利用細胞大小差異的慣性效應不同，適用于大于背景血液細胞的CTC 分離。這種方法已被結(jié)合到許多微流體裝置中，顯示出高靈敏度，并保持CTC 活性［24］。

癌細胞的介電特性與血細胞明顯不同。Becker等［25］證明了乳腺癌細胞系、淋巴細胞和紅細胞中的不同介電參數(shù)。癌細胞和血細胞之間的介電差異可能是由細胞膜的不同形態(tài)特征引起的，包括微絨毛、膜褶皺和起泡。DEP Array 技術可將單個細胞捕獲在介電泳籠中，并已用于回收單個CTC 以進行高度特異性的遺傳分析［26］。

無富集檢測方法：所有富集技術都需要驗證捕獲的細胞，這可能非常耗時。高速熒光成像領域的進步推動了成像平臺的發(fā)展，無需富集步驟即可直接從血液樣本中鑒定CTC。成像流式細胞術使用核質(zhì)比和大小等參數(shù)區(qū)分CTC 和白細胞［27］。光聲流式細胞術是一種檢測CTC 的獨特體內(nèi)直接成像方法，使用基于激光的技術實時檢測靜脈中的CTC［28］。

3 CTC 作為HCC 的生物標志物

2013 年Sun 等［29］使用CellSearch 檢測行肝癌切除術的HCC 患者的EpCAM + CTC，其中67%術前檢測陽性。術前CTC 計數(shù)≥2 被認為是術后腫瘤復發(fā)的高危因素。使用CellSearch 的其他研究表明，EpCAM + CTC 與血管侵襲、高AFP、巴塞羅那臨床肝癌分期晚、高復發(fā)率及更短生存期密切相關［30-32］。但值得注意的是只有30%～40%的HCC 細胞表達EpCAM，且EMT CTC 上皮標志物丟失，不適用基于EpCAM 的CTC 富集方案［33］。

去唾液酸糖蛋白受體ASGPR 是一種僅在肝細胞表面表達的跨膜蛋白，已用于富集方法檢測HCC CTC。2016 年Zhang 等［34］用ASGPR、P-CK 和CPS1 抗體的CTC 芯片100%分離出CTC。Court 等［35］用帶有EpCAM、ASGPR 和GPC3 多標志物組的NanoVelcro CTC 檢測在97%的HCC 患者中捕獲了CTC。

2000 年Vona 等［18］使用二維微濾系統(tǒng)ISET 檢測肝切除術的HCC CTC，能夠在術中捕獲腫瘤微栓子。Vona 等［36］發(fā)現(xiàn)ISET 檢測的CTC 數(shù)量與彌漫性肝癌、門靜脈癌栓等晚期病變及更短生存期密切相關。Morris 比較CellSearch 和ISET 檢測HCC CTC的能力，顯示ISET 具有更為優(yōu)越的性能（ISET：100%，CellSearch：28%）［37］。ISET 的缺點是難以釋放CTC 用于下游遺傳分析。

2016 年Liu 等［21］使用成像流式細胞術IFC，利用更高的核質(zhì)比來檢測CTC。Ogle 等［38］研究IFC則通過細胞大小，并將其有效性與由CK、EpCAM、AFP、GPC-3 和DNA-K 組成的多標志物組進行比較。包含大小標準的IFC 與CD45 陰性富集相結(jié)合，捕獲所有陽性生物標志物CTC，以及28%不表達生物標志物的CTC。

鑒定特定腫瘤標志物和藥物靶標表達可用于預測治療反應性。Shi 等［39］使用3 種CTC 標志物MAGE3、survivin 和CEA 評估冷凍術對不可切除HCC 的療效，發(fā)現(xiàn)它們在預測治療反應方面是可靠的。2016 年Li 等［40］通過檢測晚期HCC CTC pERK和pAkt 的表達狀態(tài)來預判索拉非尼療效。在pERK/pAkt 表達的不同模式中，pERK+/pAkt-CTC 與更長的無進展生存期和更高的索拉非尼反應率顯著相關。Winograd 等［41］評估了在HCC 患者中表達程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）的CTC，發(fā)現(xiàn)PD-L1+CTC 可區(qū)分早期和晚期/轉(zhuǎn)移性疾病。在接受抗程序性死亡蛋白1 治療的6 例患者中，所有3 例表現(xiàn)出反應的患者都有PD-L1+CTC，而3 例無反應者中只有1 例陽性，表明PD-L1+CTC 可預測免疫治療反應。2017 年，Kalinich 等［42］使用CTC-iChip 分離CTC，應用基于RNA 數(shù)字PCR檢測肝臟特異性轉(zhuǎn)錄物，這些轉(zhuǎn)錄物被組合成一個單一的度量CTC 分數(shù)。CTC 評分與BCLC 分期高度相關，且在接受治療的患者中下降。

EMT 標志物已被研究預測HCC 復發(fā)和預后。CanPatrol CTC 分析平臺是一種兩步技術，包括微濾和隨后使用各種上皮（EpCAM、CK8/9/19）和間充質(zhì)標志物（vimentin、twist）［43］。Wang 等［43］研究了62 例接受手術切除的HCC 患者，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)CTC數(shù)量較多的患者復發(fā)風險增加，無病生存期縮短。其他研究顯示間充質(zhì)CTC 與不良臨床結(jié)果之間存在相關性［44-45］。

Yi 等［46］構建了一個基于GPC-3 平臺用于檢測HCC CTC，對HCC 罕見CTC 的檢測具有較高的特異性和敏感性。與EpCAM 和vimentin 相比，GPC-3具有更強的CTC 分離能力。CTC“陽性”計數(shù)（每7.5 ml 血液≥5 PV-CTC）與BCLC 分期存在相關性（P=0.055）。在下游檢測中發(fā)現(xiàn)，在60%的病例中，CTC-NGS 的結(jié)果與組織-NGS 結(jié)果一致，并發(fā)現(xiàn)KMT2C 是一種常見高頻突變基因。

Zhao 等［47］探索了CTC 在HCC 手術治療后復發(fā)的預測作用，發(fā)現(xiàn)與單獨分析 CTC 或 ctDNA 相比，CTC 和ctDNA 協(xié)同組合在預測復發(fā)方面表現(xiàn)出更高的敏感性（85.7%比75% / 70.4%），特異性為81.6%。該組合檢測陰性患者的無疾病復發(fā)存活時間顯著大于陽性者（HR=11.88， 95% CI=4.06 ～34.75，P ＜0.001）。

HCC CTC 存在顯著異質(zhì)性。Sun 等［48］報道了CTC 之間的這種顯著異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)不同血管腔內(nèi)的CTC 的EMT 狀態(tài)存在異質(zhì)性，釋放時主要是上皮表型，但在轉(zhuǎn)運過程中轉(zhuǎn)變?yōu)镋MT 表型。在大小和核型方面CTC 間的異質(zhì)性更大。Wang 等［49］使用減法富集和免疫染色熒光原位雜交（SE-iFISH），使用表型和核型的原位表征，發(fā)現(xiàn)存在比白細胞更小的HCC CTC，8 號染色體非整倍體率非常高。三倍體或多倍體CTC 的術后數(shù)量與預后不良顯著相關。

4 CTC 作為肝移植預后的生物標志物

2018 年Wang 等［50］報告了CTC 水平與肝移植后HCC 復發(fā)的相關性研究。這項前瞻性研究包括47 例接受肝移植并使用CanPatrol 系統(tǒng)至少接受2 次外周CTC 分析的病例。復發(fā)患者的基線Edmondson分期、累積腫瘤直徑、微血管癌栓和甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）水平更高（均P ＜0.05）。此外，70.2%的HCC 患者為CTC 陽性。盡管在肝移植后和隨訪期間，隨著上皮和間質(zhì)CTC 水平的增加，CTC 亞型的比例發(fā)生了變化，但在總CTC 或CTC亞型的變化與HCC 復發(fā)之間沒有觀察到顯著的關聯(lián)（P ＞0.05）。

Chen 等［51］研究了移植前RFA 與CTC 對肝癌肝移植預后的影響。通過負富集和imFISH方法檢測，超二倍體并具有CEP8+/DAPI+/CD45-表型的CTC，計數(shù)臨界值為1，當CTC 計數(shù)≥1 時定義為陽性。79 例患者中20 例（25.3%）肝移植后復發(fā)，其中15 例（75%）和59 例無復發(fā)患者中27 例（45.7%）CTC 呈陽性。結(jié)果顯示復發(fā)與CTC 計數(shù)、腫瘤個數(shù)、肝硬化、米蘭標準、UCSF 標準密切相關，而與術前AFP 無關。Kaplan-Meier 顯示，與CTC 陰性患者相比，CTC 陽性患者的PFS 率較低。而CTC 陰性組和CTC 陽性組之間的OS 率無顯著差異。作者認為RFA 可有效減少CTC 陽性HCC 患者的復發(fā)。移植前CTC 結(jié)果可作為HCC 患者肝移植前RFA 的指標。

Chen 等［52］另一項研究共招募50 例接受CTC檢測并接受肝移植的患者。術前CTC 陽性率和術后復發(fā)率分別為52%和24%。符合米蘭標準和UCSF 標準的患者復發(fā)率分別為8.7%和7.1%。CTC 陽性患者肝移植后復發(fā)時間早于CTC 陰性組〔（20.14±2.13） 個月比（ 28.75±1.56） 個月， P=0.020〕 。CTC 陰性和CTC 陽性患者的1 年無病生存率、總生存率分別為91.6%、91.7%和61.5%、88.5%。CTC 與腫瘤大小、AFP 水平、腫瘤分級和復發(fā)相關。CTC 是影響長期生存的唯一獨立因素。Xue 等［53］對iFISH平臺和CellSearch 系統(tǒng)進行了比較，兩種方法檢測的術前HCC CTC 百分比分別為70.00%和26.67%（P ＜0.01）。肝移植后3 個月iFISH-CTC 顯著減少〔（3.04±0.93/7.5） ml至（ 1.0±0.53/7.5） ml，P＜0.05〕。術前iFISH-CTCs 水平較低（＜5/7.5ml）的患者沒有復發(fā)生存期顯著增加（15 個月比5.5 個月，P ＜0.01）。iFISH 平臺增加了靈敏度分析，可用作CTC 的動態(tài)監(jiān)測工具。CTC 水平可作為HCC 肝移植預后良好指標。

Amado 等［54］比較了接受肝切除或肝移植的肝癌患者的CTC 特征。在手術前、術后5 d 和第30 天使用Isoflux?系統(tǒng)在外周血樣本中進行CTC 計數(shù)。納入了41 例HCC 患者，10 例患者（24.4%）進行了肝切除，31 例患者（75.6%）接受了肝移植。兩組患者術前CTC 計數(shù)相似，但術后1 個月肝移植組獲得CTC 清除更為明顯。術前存在CTC 簇狀態(tài)與術后30 d CTC 清除不全具有相關性，且與生存率顯著負相關。手術后CTC 清除不全可能是HCC 侵襲性的替代標志。Wang 等［55］分析193 例肝移植并接受術前1 d 和術后2 ～4 周CTC 檢測的HCC 患者，并選擇38 例在肝移植前可檢測到CTC 的患者在肝移植后1 個月和肝移植后約3 個月的隨訪中進行連續(xù)CTC 檢測。160 份術前合格血樣中有85 例（53.1%）檢測到術前CTC，平均CTC 計數(shù)為每5 ml中1.24±1.82（0 ～11.00）。167 例術后合格血樣中有63 例（37.7%）檢測到術后CTC，平均CTC 計數(shù)為0.71±1.15。連續(xù)檢查CTC 的38 例患者中13 例術后早期CTC 呈陰性但后來轉(zhuǎn)陽性，其中10 例（76.9%）HCC 復發(fā)。4 例CTC 持續(xù)陽性者有2 例（50.0%）復發(fā)。這12 例復發(fā)患者中，從檢測到CTC 到臨床診斷復發(fā)的中位時間為6.2（5.8±3.1）個月。而15 例CTC 陰性患者中只有1 例（6.7%）出現(xiàn)復發(fā)。腫瘤復發(fā)者的術后CTC 計數(shù)和CTC 陽性率均高于未復發(fā)患者。術后CTC 計數(shù)≥1/5 ml 可作為預測復發(fā)的潛在標志物，預測敏感性和特異性分別為59.3%和71.7%。術后CTC 計數(shù)≥1/5 ml 對AFP（≤20 ng/ml）和PIVKA-Ⅱ（≤40 mAU/ml）均陰性者也具有預后價值。作者認為術后連續(xù)CTC檢測可能有助于監(jiān)測HCC 復發(fā)。

外周血中的CTC 測量提供了有關患者疾病狀態(tài)的實時信息。此外，CTC 可以很容易地從常規(guī)抽血中獲得，對患者的風險較小。術前CTC 測量可能無法完全揭示肝移植腫瘤侵襲性和由此產(chǎn)生的復發(fā)風險。通過連續(xù)CTC 監(jiān)測進行的術后監(jiān)測有助于早期發(fā)現(xiàn)復發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤。此外，CTC 計數(shù)的增加可能出現(xiàn)在一些患者的AFP 和PIVKA-Ⅱ水平變化之前顯示腫瘤復發(fā)，為檢測早期腫瘤復發(fā)提供策略，并及時啟動化療、靶向藥物或局部治療等治療方案，提高肝移植后的長期生存率。此外，結(jié)合單CTC 測序，可以為治療管理提供許多好處。

肝移植被認為是HCC 患者的潛在治愈選擇，但其療效在很大程度上取決于術后復發(fā)的風險。優(yōu)化程序確定候選人以降低腫瘤復發(fā)率仍是重要課題。作為液體活檢的一種形式，CTC 在促進HCC 患者實施精準醫(yī)療方面具有巨大潛力。發(fā)展能夠捕獲全譜CTC 的具有高靈敏度和特異性的標準化測定方案，通過使用統(tǒng)一的CTC 檢測平臺進行更大樣本量的多中心、前瞻性研究是今后這方面發(fā)展的方向。