VASH2對腦膠質(zhì)瘤血管新生的影響機(jī)制

李宇，劉宇翔，薩麗波

(1遼寧省金秋醫(yī)院綜合老年醫(yī)學(xué)科，沈陽 110016；2沈陽醫(yī)學(xué)院生理教研室，沈陽 110034)

膠質(zhì)瘤是一種最常見的高度異質(zhì)性的原發(fā)性腦腫瘤[1]，迄今為止，現(xiàn)有的手術(shù)、放射、化學(xué)及靶向治療方法未能對疾病進(jìn)展和患者生存率產(chǎn)生強(qiáng)有力的影響[2]。腫瘤組織的生長和代謝需要膠質(zhì)瘤新生血管為其提供營養(yǎng)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖，以及腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處的浸潤和遷移[3]。膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率和死亡率高，嚴(yán)重依賴于血管生成。因此，抗血管生成治療是治療惡性膠質(zhì)瘤的一種重要治療方法[4]，值得進(jìn)行深入研究。

血管抑制素(vasohibin，VASH)是由血管抑制素-1(vasohibin1，VASH1)和血管抑制素-2(vasohibin2，VASH2)組成的對血管生成有調(diào)節(jié)作用的因子。VASH1對血管生成有抑制作用，而VASH2對血管生成有促進(jìn)作用[5]。VASH2已被證實(shí)在一些常見的人類癌癥中發(fā)揮致癌作用，VASH2被多種癌細(xì)胞表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管的生成和進(jìn)展[6]。據(jù)報(bào)道，食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal cell squamous carcinoma，ESCC)患者腫瘤高表達(dá)VASH2，預(yù)后不良[5]，子宮內(nèi)膜癌患者中VASH2通過旁分泌作用促進(jìn)血管生成[7]。最近發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中敲除VASH2可降低微管蛋白羧肽酶(tubulin carboxypeptidase，TCP)活性，以VASH2為靶點(diǎn)的卵巢癌治療策略可能實(shí)現(xiàn)對血管生成的抑制和微管活性的調(diào)節(jié)[8]。增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)以血管生成為特征，可導(dǎo)致視力下降甚至失明，研究發(fā)現(xiàn)VASH2促進(jìn)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[9]。本研究通過觀察VASH2對腦膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管形成的調(diào)控作用，探究其對腦膠質(zhì)瘤血管新生的影響機(jī)制，希望能為膠質(zhì)瘤的抗血管生成治療提供一種新策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系hCMEC/D3(上海富衡生物科技有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone)；ECM內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(Scien Cell)；胎牛血清(ABW公司)；VASH2過表達(dá)和沉默轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(蘇州吉瑪公司)；脂質(zhì)體LTX，含Plus 試劑(Lipofectamine LTX and Plus，美國生命技術(shù)公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8 (cell counting kit-8，CCK-8，日本同仁公司)；吉姆薩工作液、胰蛋白酶(北京索萊寶公司)；基質(zhì)膠(美國碧迪公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立人腦膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞模型 U87細(xì)胞長到近融合時棄去DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)，用無血清DMEM培養(yǎng)液沖洗2次后加入無血清ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)液，培養(yǎng)液在4 ℃離心機(jī)中以離心力2000 g 離心10 min，收集上清液，加入5%胎牛血清，1%內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，配成膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液。用膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液培養(yǎng)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞hCMEC/D3(ECs)72 h后，人腦膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞(glioma microvascular endothelial cells，GECs)模型建立成功。

1.2.2 建立VASH2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系 sh-VASH2質(zhì)粒載體為pGPU6/GFP/Neo，序列5′-3′為GCCTTCTTGGCAAAGCCTTCA，VASH2過表達(dá)質(zhì)粒以pcDNA3.1(+)為載體，將GECs細(xì)胞在生長狀態(tài)良好的情況下接種于24孔板中，相應(yīng)質(zhì)粒的空載體為陰性對照。將VASH2過表達(dá)和表達(dá)沉默的質(zhì)粒及相應(yīng)的陰性對照質(zhì)粒用Lipofectamine LTX and Plus分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，經(jīng)G418篩選培養(yǎng)大約4周后得到VASH2過表達(dá)和表達(dá)沉默的膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞系。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中分組：空白對照組、VASH2過表達(dá)陰性對照空質(zhì)粒[VASH2(+)NC]組、VASH2過表達(dá)[VASH2(+)]組、VASH2表達(dá)沉默陰性對照空質(zhì)粒[VASH2(-)NC]組和VASH2表達(dá)沉默[VASH2(-)]組。

1.2.3 CCK-8細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn) 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種轉(zhuǎn)染后分組的GECs細(xì)胞，密度為2000個/孔，每孔加入膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液200 μl，24 h后換液，每孔加入膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液100 μl后再每孔加入10 μl CCK-8，孵育2 h后，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測A450 nm。細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組A450 nm-空白A450 nm)/(對照組A450 nm-空白A450 nm)×100%。

1.2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中放入穿透小室(transwell chamber)，在其上室加入轉(zhuǎn)染后分組的GECs細(xì)胞100 μl，密度為5×105/ml，培養(yǎng)液為無血清膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液，下室加入600 μl含5%胎牛血清的膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，然后取出transwell小室，用棉簽輕輕拭去小室上表面的細(xì)胞，下表面細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min后，用0.5%結(jié)晶紫染色30 min，PBS充分沖洗，隨機(jī)在高倍鏡視野中選取5個視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移的數(shù)目。

1.2.5 體外血管形成實(shí)驗(yàn) 在96孔板中，每孔加入基質(zhì)膠100 μl，37 ℃放置30 min后每孔加入100 μl轉(zhuǎn)染后分組的GECs細(xì)胞，密度為4×105/ml，由膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后隨機(jī)取3個高倍鏡視野進(jìn)行拍照，應(yīng)用ImageJ軟件對圖片進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)微血管的長度及分支數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 VASH2對GECs增殖能力的影響

分別上調(diào)和下調(diào)GECs中VASH2的表達(dá)后，檢測GECs增殖能力的改變。與空白對照組比較，VASH2(+)NC組和VASH2(-)NC組GECs增殖能力均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化。VASH2(+)組與VASH2(+)NC組比較，細(xì)胞的增殖能力明顯增加(P<0.05)；VASH2(-)組與VASH2(-)NC組比較，VASH2(-)組細(xì)胞的增殖能力明顯降低(P<0.05)。VASH2對GECs增殖能力的影響詳見圖1。

圖1 VASH2對GECs增殖能力的影響Figure 1 Effect of VASH2 on GECs proliferation ability (n=3) VASH2: vasohibin2; GECs: glioma microvascular endothelial cells. Compared with VASH2(+)NC group, *P<0.05; compared with VASH2(-)NC group, #P<0.05.

2.2 VASH2對GECs遷移能力的影響

分別上調(diào)和下調(diào)GECs中VASH2的表達(dá)后，檢測GECs遷移能力的改變。與空白對照組比較，VASH2(+)NC組和VASH2(-)NC組GECs遷移能力均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化。VASH2(+)組與VASH2(+)NC組比較，細(xì)胞的遷移能力明顯增加(P<0.05)；VASH2(-)組與VASH2(-)NC組比較，VASH2(-)組細(xì)胞的遷移能力明顯降低(P<0.05)。VASH2對GECs遷移能力的影響詳見圖2。

2.3 VASH2對GECs管形成能力的影響

分別上調(diào)和下調(diào)GECs中VASH2的表達(dá)后，檢測GECs管形成能力的改變。與空白對照組比較，VASH2(+)NC組和VASH2(-)NC組GECs管形成能力均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化；VASH2(+)組與VASH2(+)NC組比較，細(xì)胞的管形成能力明顯增加(P<0.05)；VASH2(-)組與VASH2(-)NC組比較，細(xì)胞的管形成能力明顯降低(P<0.05)。VASH2對GECs管形成能力的影響詳見圖3。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，上調(diào)GECs中VASH2的表達(dá)后，GECs增殖、遷移和管形成的能力均增強(qiáng)；下調(diào)GECs中VASH2的表達(dá)后，GECs的增殖、遷移和管形成的能力均減弱。證明了VASH2對腦膠質(zhì)瘤血管新生具有一定的調(diào)控作用。膠質(zhì)瘤的進(jìn)展取決于腫瘤血管的生長，膠質(zhì)瘤細(xì)胞能分泌血管內(nèi)皮生長因子等促血管生成因子促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長。此外，膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞還分泌多種促進(jìn)腫瘤生長的因子，這些分泌因子的相互作用可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤生長[4]。因此，抗血管生成治療被認(rèn)為是治療惡性膠質(zhì)瘤的重要方法。

圖2 VASH2對GECs遷移能力的影響Figure 2 Effect of VASH2 on GECs migration ability (n=3; crystal violet staining×200)VASH2: vasohibin2; GECs: glioma microvascular endothelial cells. Compared with VASH2(+)NC group, *P<0.05; compared with VASH2(-)NC group,#P<0.05.

圖3 VASH2對GECs管形成能力的影響Figure 3 Effect of VASH2 on GECs tube formation ability (n=3; ×200) VASH2: vasohibin2; GECs: glioma microvascular endothelial cells. Compared with VASH2 (+)NC group,*P<0.05; comared with VASH2(-)NC group,#P<0.05.

近年來已有研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中miR-383通過血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)介導(dǎo)的黏附斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)和肉瘤癌基因/酪氨酸激酶(sarcoma oncogene/tyrosine kinase，Src)信號通路抑制GECs的增殖、遷移和管形成[10]。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)FUS/circ_002136/miR-138-5p/SOX13反饋環(huán)在調(diào)控血管新生方面發(fā)揮重要作用，下調(diào)融合肉瘤基因(fused in sarcoma，F(xiàn)US) 或 環(huán)狀RNA circ_002136通過反饋環(huán)的信號通路可以顯著抑制GECs的增殖、遷移和管形成的能力。 SRY盒轉(zhuǎn)錄因子13 (SRY-box transcription factor 13，SOX13)能結(jié)合并激活脊椎蛋白2(spondin 2，SPON2)啟動子，從而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)SPON2的表達(dá)。下調(diào)SPON2的表達(dá)能夠抑制GECs的管生成，更重要的是SOX13還能激活FUS啟動子并增加其活性，形成反饋循環(huán)[11]。RNA 結(jié)合蛋白莫洛尼白血病病毒10(Moloney leukemia virus 10，MOV10) 通過與環(huán)狀RNA circ-DICER1結(jié)合，通過miR-103a-3p/miR-382-5p通路改變小腦鋅指結(jié)構(gòu)4(zinc finger of the cerebellum 4，ZIC4)在GECs中的表達(dá)，ZIC4 能夠調(diào)控下游靶基因熱休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90β) 通過PI3K/Akt信號通路調(diào)控GECs的增殖、遷移和血管形成的能力[12]。在膠質(zhì)瘤中VASH2對血管生成的影響與哪些因子調(diào)控有關(guān)還有待進(jìn)一步深入研究。

近年來的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌、肝癌、卵巢癌和乳腺癌中腫瘤血管的生成也與VASH2的調(diào)控密切相關(guān)。Iida-Norita等[13]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者高表達(dá)VASH2顯示預(yù)后較差，并闡明了它在腫瘤微環(huán)境中的作用，當(dāng)VASH2被敲除時，腫瘤血管生成在體內(nèi)被顯著抑制，這一現(xiàn)象與趨化因子、細(xì)胞因子及骨髓源性抑制細(xì)胞的募集有關(guān)[13]。在胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma， PDAC)中VASH2的過度表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管生成和增殖，加速了腫瘤向更嚴(yán)重的惡性表型發(fā)展的步伐，并與較差的臨床結(jié)果相關(guān)。VASH2可能是術(shù)后PDAC治療的一個重要新靶點(diǎn)[14]。VASH2能夠通過調(diào)控腫瘤血管生成進(jìn)而調(diào)節(jié)胃腸道腫瘤的發(fā)生[15]]。肝細(xì)胞癌的惡性生長和轉(zhuǎn)移與血管的生成有密切關(guān)系。進(jìn)一步研究表明，VASH2介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞生長因子-2、血管內(nèi)皮生長因子和血管抑制素1的轉(zhuǎn)錄增加可能是這些作用的機(jī)制。由于組蛋白修飾，VASH2在肝癌細(xì)胞中異常表達(dá)，并且VASH2通過小血管抑制蛋白結(jié)合蛋白(small vasohibin binding protein，SVBP)介導(dǎo)的旁分泌機(jī)制參與肝癌的血管生成。表明VASH2在肝癌血管生成和惡性轉(zhuǎn)化中具有重要作用[16]。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)VASH2可促進(jìn)干細(xì)胞的侵襲，減少細(xì)胞凋亡，增加干細(xì)胞的比例。研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中VASH2的表達(dá)能夠通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化[17]。

在漿液性卵巢癌中VASH2刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移，其在癌細(xì)胞中的表達(dá)增加與mir-200b的減少有關(guān)。在漿液性卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)的VASH2通過促進(jìn)血管生成促進(jìn)腫瘤生長和腹膜播散[18]。通過研究VASH2在200例乳腺癌組織中的血管生成功能和作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)VASH2與血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31)陽性微血管密度呈正相關(guān)，在異種移植瘤中誘導(dǎo)血管生成，并促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管的形成。此外，VASH2調(diào)節(jié)人乳腺癌細(xì)胞中成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)的表達(dá)，并且在體外通過FGF2中和阻斷VASH2過度表達(dá)誘導(dǎo)的促血管生成作用。FGF2啟動子通過組蛋白修飾被VASH2轉(zhuǎn)錄激活。總之，VASH2的表達(dá)與FGF2的表達(dá)呈正相關(guān)，并通過非旁分泌機(jī)制轉(zhuǎn)錄激活成纖維細(xì)胞生長因子2，促進(jìn)管腔乳腺癌的血管生成[19]。

VASH2對腦膠質(zhì)瘤管形成的具體調(diào)控作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究，從而為腦膠質(zhì)瘤的綜合治療提供新靶點(diǎn)和新策略。